乙肝兩對(duì)半是診斷、治療乙肝的有效指標(biāo)，臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測乙肝兩對(duì)半，該法穩(wěn)定、靈敏度高、易操作、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。在ELISA實(shí)際檢驗(yàn)過程中常會(huì)受到多種因素的影響，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與事實(shí)存在一定的誤差。本文現(xiàn)探討ELISA法檢測乙肝兩對(duì)半的影響因素和臨床意義，詳情報(bào)道如下。

1檢測前的影響因素

1.1標(biāo)本的影響

1.1.1標(biāo)本采集

紅細(xì)胞破裂釋放的過氧化物酶等物質(zhì)可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成假陽性或假陰性，因此在采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)盡量避免溶血；抗凝不完全也可因纖維蛋白原干擾出現(xiàn)假陽性，因此檢測過程盡量不采用抗凝血，尤其避免使用肝素抗凝的血液標(biāo)本；標(biāo)本中含有細(xì)菌、支原體、衣原體等微生物同樣會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾；試驗(yàn)過程中使用一次性非抗凝真空試管，避免試管等器械的交叉使用，避免因交叉污染造成結(jié)果出現(xiàn)假陽性。另外部分血液樣本中存在的類風(fēng)濕因子、脂濁、黃疸及甲胎蛋白等因素也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.1.2標(biāo)本保存

標(biāo)本可在-20℃存放1年，使用前解凍，室溫平衡30min，但反復(fù)凍融次數(shù)不宜不超過3次。另外儲(chǔ)存于2～8℃的標(biāo)本，存放時(shí)間超過1周也可能影響結(jié)果。

1.2試劑盒影響

1.2.1試劑盒的選擇

ELISA試劑盒應(yīng)選擇國家有關(guān)部門檢定合格的產(chǎn)品，目前，國內(nèi)ELISA試劑盒的質(zhì)量參差不齊，進(jìn)口試劑盒質(zhì)量相對(duì)較好，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇準(zhǔn)確度好、靈敏度高和重復(fù)性好的試劑盒，以保障試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1.2.2試劑盒的保存

ELISA試劑盒儲(chǔ)存于2～8℃，并作好實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏記錄。試劑盒使用前于室溫平衡30min，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3檢驗(yàn)人員的影響

檢驗(yàn)醫(yī)師需定期進(jìn)行相關(guān)培訓(xùn)，了解酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理和操作要點(diǎn)。掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于乙肝兩對(duì)半測定的質(zhì)控方法原理及失控處理原則。熟悉試劑盒性能，熟悉操作儀器及正確的操作方法。了解乙肝兩對(duì)半標(biāo)志物之間存在意義。

1.4質(zhì)控方法的選擇

ELISA法檢測乙肝兩對(duì)半定性檢測法質(zhì)量高低意義在于是否能夠檢出病原體或抗體。室內(nèi)質(zhì)控對(duì)于乙肝兩對(duì)半定性實(shí)驗(yàn)的靈敏性和特異性具有重要意義，因此尋求合適的室內(nèi)質(zhì)控方法是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。我們應(yīng)用Levey-Jerminings質(zhì)控圖法和即刻法室內(nèi)質(zhì)控法于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)仍有不足，實(shí)驗(yàn)過程中受到HOOK effeCT的影響，隨待測物濃度增加，抗原抗體結(jié)合物濃度也會(huì)增加，然而OD值會(huì)在升高至一定程度后開始下降，上述質(zhì)控方法無法很好的顯示出來。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)對(duì)失控標(biāo)本重復(fù)檢驗(yàn)，對(duì)灰區(qū)結(jié)果重復(fù)檢驗(yàn)，登記后報(bào)告，提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確率。積極主動(dòng)參加上級(jí)部門組織的室間質(zhì)評(píng)工作，找出差距及時(shí)糾正，提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率和準(zhǔn)確性。

2檢驗(yàn)過程的影響因素

2.1加樣

吸嘴的清潔程度和吸量的準(zhǔn)確性會(huì)直接影響到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，加樣過程中檢驗(yàn)醫(yī)師應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，吸頭是一次性使用，向反應(yīng)孔加標(biāo)本時(shí)應(yīng)將吸頭尖觸及到反應(yīng)孔側(cè)壁下1/3處，注意避免污染其他反應(yīng)孔。放到溫育箱前，所加樣需在振蕩器上震蕩30s以上使充分混勻。

2.2溫育

溫育是ELISA法中至關(guān)重要的一步，不同的溫育環(huán)境對(duì)檢測結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，嚴(yán)格控制溫育時(shí)間和溫度。標(biāo)本加入板孔中后一出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，多數(shù)情況下最貼近孔壁的一層溶液中的待測成分會(huì)直接反應(yīng)，因而室溫下反應(yīng)很慢，須在37℃環(huán)境中擴(kuò)散至平衡。干育時(shí)會(huì)產(chǎn)生周邊效應(yīng)，應(yīng)反應(yīng)板周邊孔與中間孔之間存在溫度差異，這樣升溫速率差會(huì)直接影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)使用水育保障整板溫度的快速平衡，減少邊緣效應(yīng)帶來的誤差。同時(shí)注意溫育時(shí)貼密封膜，謹(jǐn)防污染。

2.3洗板

洗板可分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物，同時(shí)去除非特異性吸附蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)。洗板使用的洗滌液一般為中性緩沖溶液，含一定的非離子型洗滌劑。洗板時(shí)須將反應(yīng)孔底部保持平整，確保每次放液加滿、吸液吸凈。洗板時(shí)均應(yīng)使用新鮮制造的去離子水稀釋洗滌劑，避免因洗滌劑受污染而影響洗板的效果。洗凈后選擇潔凈的吸水紙進(jìn)行拍干，防止污染。手工洗板注意避免孔內(nèi)洗滌液外溢，嚴(yán)格控制鄰孔互相造成的污染。

2.4顯色及結(jié)果判斷

顯色是最后一步溫育反應(yīng)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間均會(huì)影響結(jié)果，一般底物載7℃顯色10～40min完成反應(yīng)，顯色時(shí)間不宜過短，避免因一些低滴度可能未能及時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)而造成假陰性結(jié)果。規(guī)定時(shí)間內(nèi)，陽性孔顏色隨時(shí)間加長逐漸加深，陰性孔無變化。操作時(shí)，A、B液按照順序加入，且間隔不超過10min，染色劑使用不宜過多，反應(yīng)在暗室或避光環(huán)境中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)果應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，一般為加入終止液10min內(nèi)完成，同時(shí)避免強(qiáng)光下操作，避免孔內(nèi)結(jié)晶影響酶標(biāo)儀測試。加終止液時(shí)避免出現(xiàn)氣泡使OD值過高，造成假陽性結(jié)果。如果顯色但酶標(biāo)儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本應(yīng)重復(fù)檢驗(yàn)并使用參比試劑，確證結(jié)果。

3其他因素影響

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境同樣會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，控制實(shí)驗(yàn)室的溫、濕度，濕度控制在35%～65%之間，操作時(shí)避免電磁干擾和噪音干擾。

4討論

乙肝是嚴(yán)重危害患者身心健康的常見傳染性疾病之一，對(duì)患者的生活、學(xué)習(xí)及工作均有不利影響，因此早期診斷對(duì)于患者控制病情具有重要臨床意義。血清兩對(duì)半檢測對(duì)乙肝的診斷和病情診斷具有重要作用，酶聯(lián)免疫吸附法是一種特殊的試劑分析方法，其結(jié)果判斷較為客觀，廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒、結(jié)核及艾滋等疾病的診斷，但易受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑選擇、試劑盒質(zhì)量、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作掌握熟練程度、顯色及結(jié)果判讀等多種因素的影響，如不注意可能導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。因此檢驗(yàn)醫(yī)師應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作，設(shè)立陰陽對(duì)照及臨界值測定，做好室內(nèi)質(zhì)控，對(duì)存疑的檢測結(jié)果進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，避免假陰、假陽性結(jié)果，影響病情判斷。