摘要：目的：分析抗精子抗體的測定方法，推進其醫(yī)學(xué)研究進展，在臨床中得到更廣泛地應(yīng)用。方法：在實驗室環(huán)境下，采用間接法原理的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。結(jié)論：JETLIA-962型微孔板單光子計數(shù)儀或其他發(fā)光免疫分析儀，包括振蕩器、洗板機、水浴箱，可對抗精子抗體進行精確的測定，使精子質(zhì)膜顆粒的流動性而阻礙獲能，阻止精子穿過透明帶與卵子的結(jié)合，引起受精的失敗，引起不育不孕具有重要意義。

關(guān)鍵詞：抗精子抗體；檢驗方法；臨床意義

【中圖分類號】R4 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）03-0110-02

抗精子抗體（ASA）采用間接法原理的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。純化的相應(yīng)抗原物質(zhì)預(yù)先結(jié)合在微孔板的表面，加入待測樣本后，樣本中相應(yīng)的抗體與微孔板表面的抗原特異性結(jié)合，洗滌后，形成的免疫復(fù)合物與隨后加入的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗人單克隆抗體相結(jié)合，這樣在微孔板表面形成了抗原一特異性抗體一酶標(biāo)記二抗的免疫復(fù)合物，洗滌后加入發(fā)光底物，測定相對發(fā)光強度，與同時測定的陰性對照品相比較，確定樣本中是否存在相應(yīng)抗體。下面將抗精子抗體的測定方法及臨床意義分析匯報如下。

1 檢驗準(zhǔn)備

1.1 標(biāo)本采集

采血方法：采集無抗凝靜脈血2～3ml，也可采集EDTA（1.5g/L全血）、枸櫞酸鈉（10.9mmol/L全血）或肝素（20～30U/ml全血）作抗凝劑的血漿。

標(biāo)本保存：室溫保存，及時檢測。樣本在15～25℃放置不超過4h；2～8℃保存不超過12h；-20℃或低于～20℃保存不超過2個月，避免反復(fù)凍融；復(fù)融的凍存樣本應(yīng)充分平衡至室內(nèi)溫度后方可用于測定。

1.2 注意事項

推薦選用血清，測定前應(yīng)平衡至室內(nèi)溫度。樣本中含有疊氮鈉、微型顆粒物會影響實驗結(jié)果，同時應(yīng)避免使用乳糜血、高蛋白血、低膽紅素血、輕微溶血或生物污染的血液標(biāo)本。

1.3 試劑

試劑來源：采用北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供配套試劑。

試劑組成：包被板：8×12條（96人份）或8×6條（48人份）；酶結(jié)合物2瓶（96人份）或1瓶（48人份）；陽性對照1瓶；陰性對照l瓶；樣本稀釋液1瓶；發(fā)光液A l瓶；發(fā)光液B l瓶；濃縮洗滌劑1瓶。

1.4 試劑準(zhǔn)備：試劑應(yīng)置室溫平衡30min。用蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋20倍后使用。液體試劑使用前應(yīng)充分混勻。

1.5 試劑保存：未開封試劑盒及其各組分在2～8℃可保存至有效期。開封使用后酶結(jié)合物、陰性對照、陽性對照、樣本稀釋液、洗滌液可于2～8℃穩(wěn)定4周；包被板、發(fā)光液穩(wěn)定8周。

1.6 儀器：采用JETLIA-962型微孔板單光子計數(shù)儀或其他發(fā)光免疫分析儀，包括振蕩器、洗板機、水浴箱。

2 檢驗步驟

2.1 實驗設(shè)計：根據(jù)陰性、陽性對照、質(zhì)控品及樣本數(shù)量截取微孔板條，在板架上放好微孔板條（陰性對照品至少設(shè)3孔，陽性對照品至少設(shè)l孔）。

2.2 加樣：在陰性、陽性對照品孔位中分別加入l00μl的陰性、陽性對照。在相應(yīng)的待測樣本孔位中分別加入lOOμl的樣本稀釋液和lOμl樣本或質(zhì)控品（建議先加入樣本稀釋液），加入樣本時應(yīng)吸打混勻（樣本孔會變藍，提示已加樣）。

2.3 溫育：蓋上封板膜，在振蕩器上振蕩片刻（不少于5s），置37℃水浴箱中溫育30min。

2.4 洗板：機洗或手洗。吸出或倒出反應(yīng)液，加入洗滌液洗5次（每次加入洗液后靜置時間不少于30s），洗滌液量每次每孔不少于300 μl，末次洗板后將板拍干。

2.5 加酶結(jié)合物：每孔依次加入lOOμl酶結(jié)合物。

2.6 溫育：同步驟2.3。

2.7 洗板：同步驟2.4。

2.8 檢測：用加樣器向每孔中分別加入發(fā)光液A、B液各50μl（共lOOμl），振蕩片刻（不少于5s），避光放置（5±0.5）min，測定相對發(fā)光強度。

2.9 設(shè)定孔位信息：在軟件支持下將各孔位按實驗需要進行定義，并按軟件提示輸入相關(guān)信息。

3 注意事項

3.1 環(huán)境相對濕度低于60%時，應(yīng)關(guān)注樣本及液體試劑蒸發(fā)濃縮對實驗結(jié)果的影響。

3.2 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，不可混用不同批號試劑及過期試劑。使用前試劑需平衡至室溫。樣本和試劑不能長時間于室溫放置，使用后剩余組分應(yīng)迅速放回2～8℃保存。

3.3 實驗過程中發(fā)光液和酶標(biāo)記物要避免強光直射。

3.4 試劑和樣本使用前要充分混勻并避免起泡，沿孔壁加樣以避免外濺或產(chǎn)生氣泡。

3.5 孵育及振蕩過程中要避免微孔內(nèi)水分的蒸發(fā)，應(yīng)及時蓋上蓋板膜。

3.6 洗板時每次加入洗液量不能太多，以免造成溢液污染。

3.7 加入發(fā)光液后避光放置（5±0.5）min，測定相對發(fā)光強度，測定時的室內(nèi)溫度應(yīng)在20～30℃。

4 結(jié)果判定

陰性對照品的平均RLU的2.1倍為Cut-Off值。用每個樣本的RLU與Cut-Off值的比值（S/CO）來判斷該樣本為陰性或陽性。S/CO≤1.0的為陰性，>1.0為陽性，配套儀器中的操作軟件可自動完成上述判斷，也可以選擇人工計算。測定正常參考值所用樣本均為-20℃冷凍后復(fù)融的血清樣本。各實驗室應(yīng)建立自己的Cut-Off值，上述Cut-Off值僅供參考。

5 臨床意義

抗精子抗體是由于男性的血睪屏障破壞，或女性的生殖器官的炎癥、損傷造成精子進入血液或淋巴循環(huán)，與免疫系統(tǒng)接觸，引發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體，無論精液還是宮頸黏液中存在的ASA抗體，接觸精子后都會使其產(chǎn)生運動特征的改變，并影響精子質(zhì)膜顆粒的流動性而阻礙獲能，阻止精子穿過透明帶與卵子的結(jié)合，引起受精的失敗，引起不育不孕。

參考文獻

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