常規(guī)抗生素會改變正常腸道菌群的數(shù)量和復雜性，進而會降低這些具有保護作用的微生物在胃腸道內(nèi)的競爭性定植的能力。因此，容易導致艱難梭菌感染（Clostridium Difficile Infection，CDI）。一旦在結腸中定植，艱難梭菌會產(chǎn)生毒素A（Clostridium difficile Toxin A，TcdA）和毒素B（Clostridium difficile Toxin B，TcdB），引起包括腹瀉、偽膜性結腸炎、中毒性巨結腸及可能致命的多系統(tǒng)器官衰竭等臨床癥狀。

治療CDI公認的方法是使用對艱難梭菌敏感的抗生素。在大約80 %的病例中，這種治療方法會完全康復，而在剩余病例中，會發(fā)生遷延性CDI（rCDI），這是因為停用甲硝唑抗生素后未能重建正常胃腸道菌群，導致對艱難梭菌敏感人群復發(fā)或再發(fā)生CDI。

雖然對TcdA和TcdB在CDI發(fā)病機制中的作用了解較多，但對其在艱難梭菌腸道定植中的作用了解甚少。不過，有跡象表明，艱難梭菌的確在哺乳動物胃腸道中定植。比如定植艱難梭菌的無癥狀患者表現(xiàn)出發(fā)生CDI風險下降，以克林霉素治療的倉鼠預定植不產(chǎn)毒艱難梭菌可保護動物不受隨后野生型產(chǎn)毒菌株感染的影響。此外，CDI患者恢復期血清含有艱難梭菌細胞壁相關成分的抗體（如FliC、FliD、Fbp68、SlpA、Cwp66和Cwp84），在體外研究中發(fā)現(xiàn)這些成分與微生物定植有關。

本研究使用了三種公認的艱難梭菌定植因子（CFs）特異性卵黃抗體（IgY）和候選疫苗，即鞭毛的結構蛋白（鞭毛蛋白）FliC、鞭毛帽蛋白FliD及84 kDa細胞壁相關半胱氨酸蛋白酶Cwp84（參與表面層蛋白SlpA的正確加工和組裝）。有充分證據(jù)表明，在通過多種哺乳動物的胃腸道后，純化的IgG及IgY抗體仍保持其抑菌活性。CF-特異性IgY制劑可促進CDI患者清除腸道中的艱難梭菌，同時保護正常胃腸道菌群，降低rCDI的發(fā)病率。

1 方法

1.1 艱難梭菌菌株及培養(yǎng)方法

艱難梭菌630菌株承蒙韋爾科姆基金會桑格研究所的Trevor Lawley博士提供。艱難梭菌VPI 10463（ATCC 43255）菌株從美國典型菌種保藏中心獲得。艱難梭菌菌株常規(guī)培養(yǎng)在源于冷凍原液的Y瓊脂平板培養(yǎng)基中[腦心浸液（BHI）瓊脂，含5 %綿羊血、5 mg血紅素和1 mg的維生素K1]，并在Bactron III型厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。在黏附試驗中，將單個菌落接種于BHI培養(yǎng)基，并在37 ℃下厭氧培養(yǎng)18 h，直至培養(yǎng)物達到指數(shù)生長后期。

用于驗證泳動瓊脂分析的艱難梭菌630 fliC基因阻斷突變株（Cdi-fliC-260a）按照Heap等介紹的方法在實驗室利用基于ClosTron組II型內(nèi)含子突變系統(tǒng)構建。Western免疫印跡分析、透射電鏡和瓊脂管泳動分析表明，這種fliC基因阻斷突變株缺乏生成鞭毛蛋白（FliC）以及組裝功能性鞭毛絲狀體的能力。

1.2 人體腸道T84細胞培養(yǎng)物狀況

T84細胞在5 % CO2、37 ℃的24孔組織培養(yǎng)平板中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為添加10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3 克隆FliC、FliD和Cwp84抗原

FliC、FliD和Cwp84基因是由卡爾加里大學醫(yī)學院托馬斯·路易博士提供的艱難梭菌卡PCR擴增而得。按照文獻所述設計PCR引物，然后按廠家說明將PCR產(chǎn)物克隆到pQE-30 UA。用標準的化學轉化方法將克隆產(chǎn)物轉化到大腸桿菌M15細胞。按照廠家對pQE-30克隆系統(tǒng)的說明進行6xHis-標記蛋白的表達和純化。采用SDS-PAGE（12.5 %分離膠）分析純化蛋白（圖1），通過對凝膠蛋白質(zhì)條帶所獲胰蛋白酶肽的質(zhì)譜分析確認其成分。

1.4 雞的免疫方案

抗原制劑（0.1 mg Ni-親和純化6xHis-標記重組抗原/0.5 mL PBS，pH 7.2）在弗氏完全佐劑（1∶1）中乳化，肌內(nèi)注射給5月齡白來航胸肌。首次注射兩周后，相同劑量相同方式強化注射，2周后再次重復。第二和第三次注射以弗氏不完全佐劑代替完全佐劑。最后一次注射后一周集蛋，處理前2 ℃～4 ℃下儲存。

1.5 從凍干蛋黃粉中提純CF-特異性IgY

將2 g凍干蛋黃粉溶于150 mL冰冷蒸餾水中，使用Waring混合機高速均質(zhì)1 min，然后將pH調(diào)至5.0。2 800轉下離心40 min，調(diào)節(jié)上清液pH至4.0，加入活性炭至終濃度0.01 %（w/v）。以2 800轉的速度再次離心30 min，所得上清液以Wahtman1號濾紙過濾。濾過液用Amicon超濾杯以100 kDa的超濾膜濃縮至30 mL。濃縮的IgY溶液pH調(diào)節(jié)至9.0，加入40 %硫酸銨4 ℃下沉淀蛋白質(zhì)1 h。然后以3 000轉離心溶液30 min。獲得的硫酸銨沉淀溶解在15 mL 0.01M Tris/HCl中（pH 8.0），再次以40 %硫酸銨4 ℃下沉淀IgY 1 h。最后3 000轉離心30 min，沉淀物溶解于鈉/鉀 PBS（pH 7.2）中，使用50 kDa超濾透析膜透析過夜。

1.6 SDS-PAGE和Western免疫印跡

重組6x His-標記FliC、FliD和Cwp84從大腸桿菌Ni-親和純化，并使用12.5 %的分離膠進行SDS-PAGE分析。分離出的蛋白轉移至PVDF膜，200 V下電泳45 min。用5 %脫脂奶Tris緩沖液（TBSTM，含0.05 %Tween20，pH 7.4）封閉。初級IgY抗體稀釋在TBSTM中，并在膜下孵育1 h。然后與結合辣根過氧化物酶的羊抗-IgY二抗以1∶10 000稀釋添加到TBSTM，并與膜一起孵育1 h。以TBST（不含5 %脫脂奶的TBSTM）充分洗膜后，按照供應商的說明以持久性化學發(fā)光底物檢測試劑盒進行免疫反應性蛋白成像。

1.7 艱難梭菌泳動檢測

泳動瓊脂試管中含有終濃度為0.175 %的瓊脂BHI溶液。添加IgY抗體至終濃度為10 mg/mL。過夜培養(yǎng)物中獲得的艱難梭菌630菌株和Flic基因阻斷突變菌株垂直注入瓊脂。然后將試管在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h。

1.8 倉鼠保護實驗

體重80 g～100 g的雄性敘利亞倉鼠（Harlan實驗室）在試驗前5 d以溶解于PBS的克林霉素磷酸酯灌胃處理，劑量為30 mg/kg體重。5 d后（試驗第0天），倉鼠灌胃接受懸浮于DMEM/F12的103艱難梭菌菌630株孢子。以未免疫雞卵黃處理的倉鼠在試驗第0天以及此后每隔10 d接受懸浮于0.5 mL 0.1 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.0）的45 mg凍干粉。僅以純化FliD-特異性IgY處理的倉鼠每天接受溶于0.5 mL碳酸氫鹽緩沖液中的0.5 mg蛋白（使用二辛可寧酸測定法測定），為期10 d。以來源于未免疫雞卵黃的純化重組FliD-特異性IgY處理的動物每天接受相同量的FliD-特異性IgY（0.5 mg蛋白）+溶解于0.5 mL碳酸氫鹽緩沖液中的45 mg凍干蛋黃粉，為期10 d。每4 h檢查倉鼠，出現(xiàn)CDI癥狀時（肛周染色、反應遲鈍）馬上CO2處死。

1.9 免疫標記程序

單一的艱難梭菌630菌落在2 %甲醛/0.5 %戊二醛的50 mM二甲胂酸鈉緩沖液（pH 7.4）中厭氧懸浮20 min。然后將10 μL的固定化細菌添加到活性炭涂布的透射電鏡格柵2 min，過量溶液用濾紙輕輕吸去。將格柵樣品面向下浮于50 μL 5 % BSA的PBS溶液1 h，進行封閉。然后將格柵轉移至50 μL 1∶50稀釋的FliD-特異性IgY溶液或稀釋在5 %BSA中的對照IgY溶液1 h。以PBS徹底洗滌后，將格柵轉移至50 mL 1∶25稀釋、結合有15 nm金粒的羊抗-IgY 1 h。以PBS洗滌后，添加10 mL的1 %磷鎢酸進行格柵染色（pH 7.0）10 s。用濾紙輕輕吸去過量染色液，并使用日立H-7650透射電鏡檢查干燥格柵。

1.10 T84細胞艱難梭菌黏附試驗

所有試驗均重復3次。生長后期指數(shù)階段（OD600=0.65）的艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)物稀釋于過夜預還原的DMEM/F12[含CF-特異性或?qū)φ章腰SIgY制劑（1 mg/mL）]，并添加到濃度大約為106 cfu/mL（m.o.i.=1∶1）T84細胞單層中。組織培養(yǎng)平板在37 ℃下厭氧孵育3 h，然后以無菌PBS洗滌5次，以除去非貼壁細菌。在3 h的厭氧培養(yǎng)后使用MTT細胞殖測定法測定T84細胞的活力。為測定黏附細菌數(shù)量，以含有1 mM EDTA的0.25 %胰蛋白酶處理T84細胞，然后在無菌PBS中稀釋10倍。隨后將稀釋液分三份接種于Y瓊脂平板上。將平板在37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，所得菌落稀釋至30～300個菌落/平板后計數(shù)。

2 結果

圖1為SDS-PAGE凝膠圖像，對用于免疫雞的Ni-親和純化重組艱難梭菌FliC、FliD和Cwp84抗原進行分析。箭頭所指條帶從凝膠中切除，并用于質(zhì)譜分析中3種純化蛋白鑒別。

根據(jù)厭氧條件下抑制艱難梭菌VPI10463菌株黏附結腸T84細胞單層的能力，對重組艱難梭菌FliC、FliD或Cwp84免疫的雞所產(chǎn)卵黃進行初步篩選。試驗結果（圖2）表明，含F(xiàn)liD-特異性IgY的卵黃抑制艱難梭菌對T84細胞單層黏附效果明顯優(yōu)于其他未免疫雞所產(chǎn)卵黃（P<0.001）或有FliC-特異性IgY的卵黃（P<0.05）。雖然以1∶1∶1比例混合的三種CF-特異性卵黃制劑混合物抑制艱難梭菌黏附T84細胞的效果顯著優(yōu)于（P<0.05）FliC-特異性卵黃，不過3種制劑的混合并未優(yōu)于FliD-特異性制劑的抑制效果。因此，選擇含有FliD特異性-IgY的卵黃作進一步評估。

采用此前Ko和Ahn報道的兩步活性炭脫脂硫酸銨沉淀法由凍干卵黃純化獲得FliD特異性-IgY。SDS-PAGE分析（圖3a）表明使用這種簡單有效的方法純化IgY主要形成分子量為68 kDa和30 kDa的蛋白質(zhì)特征條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈。圖3（b）的結果表明，在免疫印跡中與FliD抗原結合的純化FliD-特異性IgY制劑與FliC或Cwp84抗原沒有交叉反應。此外，抗原捕獲型ELISA結果表明，與FliD-特異性卵黃粗制劑相比，凍干蛋黃純化FliD-特異性IgY可顯著提高其滴度（圖4）。此外，瓊脂泳動分析表明，與含對照IgY或不含IgY的瓊脂泳動相比，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑可降低艱難梭菌630菌株的活動性（圖6）。

五項獨立倉鼠CDI保護試驗得到的累計存活結果如圖7所示。數(shù)據(jù)表明，與接受未免疫雞卵黃相比，單獨使用純化FliD-特異性IgY碳酸鹽緩沖液可顯著提高（P<0.05。雙尾Fisher精確檢驗）倉鼠感染濃度為103的艱難梭菌630菌株孢子的存活率。此外，含對照卵黃的重組純化FliD-特異性IgY未顯著改變其在倉鼠CDI試驗中的保護效力。

3 討論

我們希望檢驗這樣一個假設，即針對艱難梭菌毒力因子的治療方式可能是一種更為有效的CDI治療或輔助治療措施。此前有證據(jù)表明FliD黏附于鼠盲腸黏液制劑，這表明這種鞭毛成分不僅具有調(diào)節(jié)鞭毛組裝作用及運動功能外，還是艱難梭菌的黏附素。另一項研究表明，CDI感染者生成艱難梭菌FliD、FliC、一種纖連蛋白結合蛋白Fpb68和Cwp66的血清抗體，且對艱難梭菌FliD比對FliC產(chǎn)生更為強烈的免疫應答。

本文給出的結果確認了艱難梭菌FliD鞭毛帽蛋白特異性IgY作為一種CDI或rCDI患者的替代性治療或輔助治療方法的可行性。觀察結果表明，對倉鼠CDI提供良好保護的FliD-特異性IgY制劑與這些抗體抑制艱難梭菌黏附于結腸T84細胞的卓越效果有關（圖2）。

除了在艱難梭菌定植過程中的重要作用外，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑在治療倉鼠CDI中的成功也可能與抗體似對抗原決定簇具有高親和力以及FliD蛋白接觸到抗原決定簇的數(shù)量有關。即使稀釋100 000倍，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑在Western免疫印跡中的反應性（圖3b）證明這些多克隆抗體仍對FliD抗原上抗原決定簇具有親和力。IgY制劑的高親和力也可能表示在通過宿主胃腸道期間高比例抗體的優(yōu)勢。如果存活的成分仍然能夠使致病菌失能，到達感染腸道部位時有多少制劑仍然保持物理完整性和活性并不重要。

原題名：Therapeutic potential of egg yolk antibodies fortreating Clostridium difficile infection （英文）

原作者： G. L. Mulvey等（加拿大卡爾加里大學）

參考文獻：（略）