陳達(dá)菊 曾瑞珍 楊青 朱漢勇 陳顯梅 梁計(jì)南 張志勝

摘 ?要 ?從建蘭與寒蘭雜交后代的根狀莖、試管苗和根狀莖薄層均誘導(dǎo)出試管花，誘導(dǎo)率分別為61.67%、80.00%和16.67%。對(duì)根狀莖、試管苗和根狀莖薄層試管花形成過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，試管花的形成和發(fā)育過(guò)程可分為花芽誘導(dǎo)期，花芽形態(tài)建成期，開(kāi)花期，謝花期4個(gè)時(shí)期。以試管苗為材料的試管花形態(tài)建成所需的時(shí)間最短，根狀莖次之，根狀莖薄層所需的時(shí)間最長(zhǎng)。細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果顯示，根狀莖試管花起源于皮層，其形態(tài)建成過(guò)程可分為花序原基形成期、花序原基分化期、小花原基形成期和小花原基分化期4個(gè)時(shí)期。

關(guān)鍵詞 ?蘭花;試管花;試管苗;根狀莖;薄層;細(xì)胞學(xué)觀察

中圖分類(lèi)號(hào) ?S682.31 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Morphological and Cytological Observation on Formation of

Hybrid Offspring of Cymbidium ensifolium and

C. karan Test-tube Flower

CHEN Daju1， 2， ZENG Ruizhen2， YANG Qing1， ZHU Hanyong1，

CHEN Xianmei1， LIANG Jinan2， ZHANG Zhisheng2 *

1 Institute of Biotechnology， Wenshan Academy of Agricultural Sciences， Wenshan， Yunnan 663000， China

2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding， South China Agricultural University，

Guangzhou， Guangdong 510642， China

Abstract ?Test-tube flowers were induced from rhizomes， plantlets and thin-cell layers of rhizomes of hybrid offspring of Cymbidium ensifolium and C. karan， the induction rates were 61.67%， 80.00% and 16.67%.. Forming process of in vitro flowering of rhizomes， plantlets and thin-cell layers of rhizomes were observed and the process could be divided into 4 stages： flower-bud induction， flower-bud development， flowering period， and inflorescences shed. The morphogenesis time of test-tube flower was the shortest by using of plantlets in vitro as materials， following by rhizomes， and the longest appeared in using thin-cell layers of rhizomes as material. Test-tube flower of rhizomes originated from cortex， and its formation and development could be divided into 4 stages： formation of inflorescence primordium， differentiation of inflorescence primordium， formation of floret primordium， differentiation of floret primordium.

Key words ?Orchid; Test-tube flower; Test-tube seedling; Rhizome; Thin-cell layers; Cytological observation

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.019

中國(guó)蘭花通常是指蘭屬（Cymbidium）蘭花中的一部分地生種，如春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭和寒蘭等[1]。在溫室栽培條件下，這些蘭花從種子播種到開(kāi)花至少需要5 a時(shí)間。因此研究這類(lèi)蘭花提早開(kāi)花的技術(shù)，對(duì)縮短育種周期，推動(dòng)中國(guó)蘭花育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物在離體培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生開(kāi)花現(xiàn)象，但通常頻率很低。本文將植物的器官、組織、細(xì)胞、中間繁殖體和試管苗等在離體培養(yǎng)條件下形成的花定義為試管花（test-tube flower）。1981年，王熊等[2]以建蘭[C. ensifolium（L.）SW.）]和[（C. ensifolium cv. ‘Qiulan）]為試驗(yàn)材料，建立了快速無(wú)性繁殖系，并發(fā)現(xiàn)試管幼苗開(kāi)花現(xiàn)象。1984年，王熊[3]報(bào)道秋蘭試管苗一年四季都有花蕾形成，從植株形成到花朵開(kāi)放最短只需2個(gè)月。1988年又報(bào)道成功誘導(dǎo)素心建蘭的試管開(kāi)花[4]。Zhang等[5]研究結(jié)果表明，3.3～10 μmol/L TDZ或10～33 μmol/L 2iP與1.5 μmol/L NAA結(jié)合能誘導(dǎo)建蘭的根狀莖形成早熟花，這些花形態(tài)正常，開(kāi)花時(shí)間持續(xù)2周。鄭立明等[6]將春蘭×大花蕙蘭的一個(gè)株系的原球莖及幼苗接種在附加BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基上，2個(gè)月后形成肉眼可見(jiàn)的花蕾，1～2 cm幼苗的花芽形成率達(dá)19%。近年來(lái)，雖然許多學(xué)者對(duì)試管花做了很多研究，但目前對(duì)試管花形成和發(fā)育過(guò)程缺乏系統(tǒng)的研究，同時(shí)也未見(jiàn)到以根狀莖薄層誘導(dǎo)試管花的研究報(bào)道。

本研究以建蘭（小桃紅）×寒蘭的雜種根狀莖、根狀莖薄層和試管苗為材料，研究蘭花試管花誘導(dǎo)技術(shù)及其形成和發(fā)育過(guò)程，為建立高效試管花誘導(dǎo)技術(shù)體系，加速?lài)?guó)蘭新品種選育和開(kāi)展成花機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

將小桃紅×寒蘭的雜交種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出根狀莖，繼代繁殖一定的數(shù)量后，將其中一部分進(jìn)行苗分化，另一部分繼續(xù)進(jìn)行繼代增殖。將繼代培養(yǎng)的根狀莖切成1 cm和1 mm薄層。以3 cm左右高的試管苗、1 cm根狀莖和1 mm根狀莖薄層為試驗(yàn)材料進(jìn)行試管花誘導(dǎo)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試管花的誘導(dǎo) ? 由于薄層在誘導(dǎo)過(guò)程中容易壞死，根狀莖容易分化而生根試管苗分化較難，因此采用了不同培養(yǎng)基。將根狀莖接種到MS1+6-BA 10 mg/L+蔗糖5%+1.2%卡拉粉，根狀莖薄層接種到MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 4 mg/L+5%Su+1.4%卡拉粉，試管苗接種到MS2+6-BA 8 mg/L+TDZ 0.05 mg/L+6% Su+1.2%卡拉粉培養(yǎng)基上于16～26 ℃，8 h光照，光照強(qiáng)度3～5 μmol/（m2·s）下培養(yǎng)。每天觀察和記錄材料的形態(tài)學(xué)變化，并在解剖鏡下拍照直到材料開(kāi)花。

MS1：1/12N，15P，MS基本培養(yǎng)基其他成分不變，硝酸鉀增加，磷酸二氫鉀中磷增加到15倍，不含硝酸銨;MS12：1/4N，30P，NH4-N/NO3-N：1 ∶ 5，MS基本培養(yǎng)基其他成分不變，磷酸二氫鉀中的磷增加到30倍。

1.2.2 ?試管花形成和發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察 ? 采用PEG包埋切片法[7]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?試管花的誘導(dǎo)

將根狀莖、根狀莖薄層和試管苗接種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行試管花的誘導(dǎo)（表1）。研究結(jié)果表明，根狀莖、根狀莖薄層和試管苗均能誘導(dǎo)形成試管花，且誘導(dǎo)所需要的溫度和光照條件一致，適宜的溫度和光照條件均為溫度16～25 ℃變溫，光照度3～5 μmol/（m2·s）和每日8 h光照。但不同起始材料的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基和在該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率不同。根狀莖試管花的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1+6-BA 10 mg/L+5% Su，誘導(dǎo)率為61.67%，根狀莖薄層試管花的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)為MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 4 mg/L+4% Su，誘導(dǎo)率為16.67%，試管苗試管花的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)為MS12+6-BA 8 mg/L+TDZ 0.05 mg/L+6% Su，誘導(dǎo)率為80.00%，正常開(kāi)花率為26.67%。

2.2 ?試管花形成過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 ?根狀莖試管花的形成過(guò)程 ? 小桃紅×寒蘭根狀莖材料較細(xì)，深綠色（圖1-A），接入花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，部分根狀莖周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)白色突起（圖1-B），30 d左右芽長(zhǎng)約0.5 cm，乳白色、芽尖紅色，每條根狀莖分化出1～2個(gè)芽（圖1-C），若芽呈乳白色，芽尖紅褐色，芽體晶瑩剔透，則可能是花芽。如果此時(shí)條件不適宜花芽發(fā)育，芽尖就壞死，無(wú)法分化形成花蕾或畸變。

培養(yǎng)50 d到60 d后花芽伸長(zhǎng)，長(zhǎng)出3-4個(gè)鞘包被著花序（圖1-D），這時(shí)可以確定分化出來(lái)的芽是花芽。培養(yǎng)90 d左右，苞片形成，小花可見(jiàn)，有些花序只有一朵花，而有些則有多朵花（圖1-E）。隨后小花繼續(xù)發(fā)育，100～120 d小花陸續(xù)開(kāi)放（圖1-F，圖1-G），部分小花需要培養(yǎng)150 d或者更長(zhǎng)的時(shí)間才開(kāi)放（圖1-H），開(kāi)花10 d左右顏色變淡，花干枯并開(kāi)始凋謝。

2.2.2 ?試管苗試管花的形成過(guò)程 ? 將小桃紅×寒蘭的試管苗接入花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖2-A），30 d左右，莖尖分生組織由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)，形成淺綠色或白色的鞘和花芽;40 d左右分化出苞片和小花（圖2-B）;隨后花序繼續(xù)伸長(zhǎng)，花蕾繼續(xù)發(fā)育，50～60 d花蕾清楚可見(jiàn)，并開(kāi)始向一側(cè)彎曲（圖2-C）;80 d左右小花開(kāi)放（圖2-D）。但大部分莖尖形成的花芽瘦弱且無(wú)法發(fā)育成為正?；ɑ蛘邿o(wú)法開(kāi)花。

隨著莖尖分生組織分化花芽的進(jìn)行，試管苗基部也開(kāi)始膨大，形成假鱗莖（圖2-F）。當(dāng)莖端的花芽發(fā)育到一定程度，假鱗莖上的腋芽開(kāi)始分化形成花芽（圖2-E），當(dāng)莖尖分化出的花芽壞死或花凋謝之后，側(cè)花芽迅速發(fā)育（圖2-F，2-G），培養(yǎng)100 d左右小花開(kāi)放（圖2-H），大部分側(cè)花芽比莖尖花芽壯，能正常開(kāi)花。培養(yǎng)至110 d左右，花凋謝（圖2-I）。試管花也可以從基部膨大而莖尖未分化花芽的試管苗的葉腋直接分化形成，每個(gè)葉腋都有可能分化出花芽，甚至從花序的鞘也能分化出花芽。但如果植株?duì)I養(yǎng)供應(yīng)不足或條件不適宜時(shí)，花芽不能正常發(fā)育和開(kāi)花。

2.2.3 ?根狀莖薄層試管花的形成過(guò)程 ? 將根狀莖切成薄層后接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖3-A），30 d左右，50%以上的根狀莖薄層死亡（圖3-B），存活的多為根狀莖頂端的薄層，其中大部分都能分化出錐形芽（圖3-B）;40 d后花芽開(kāi)始伸長(zhǎng)，芽尖淺褐色，彎曲（圖3-C）;80 d左右鞘分化形成，小花也開(kāi)始分化形成（圖3-D）;90 d左右花序進(jìn)一步伸長(zhǎng)（圖3-E），120 d左右，花序伸到最長(zhǎng)，小花之間分開(kāi)，含苞待放（圖3-F）。150 d左右開(kāi)放（圖3-G，3-H），然后凋謝或壞死（圖3-I）。

2.3 ?根狀莖試管花形成過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察

根狀莖是由單層細(xì)胞的表皮、皮層和中柱組成（圖4-A）。將根狀莖接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中10～15 d，皮層細(xì)胞開(kāi)始分裂形成突起（圖4-B），隨后表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞分離，在突起的下方分化產(chǎn)生維管束組織，從而形成“T”結(jié)構(gòu)（圖4-C）。此時(shí)為花序原基形成期。

隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，試管花分化進(jìn)入花序原基分化期（圖4-D），此時(shí)鞘逐漸分化形成，生殖生長(zhǎng)錐呈半球形，光滑，一直包在鞘中（圖4-E），培養(yǎng)60 d左右，鞘分化完成（圖4-F）。

苞葉原基的出現(xiàn)標(biāo)志著試管花分化進(jìn)入小花原基形成期，苞片原基的分化是從生長(zhǎng)錐基部開(kāi)始的，由于兩個(gè)苞片原基同時(shí)形成，他們和生長(zhǎng)錐一起形成品字結(jié)構(gòu)（圖4-F），隨著苞片的形成（圖4-G），生長(zhǎng)錐逐漸變尖，上面出現(xiàn)突起，接著在苞片內(nèi)側(cè)形成小花原基（圖4-H）。隨后小花原基不斷伸長(zhǎng)，中部出現(xiàn)突起，形成小花的基本形狀結(jié)構(gòu)（圖4-I），培養(yǎng)后80 d，小花分化結(jié)束。

根狀莖試管花形成過(guò)程的分期及其各期特征見(jiàn)表2。

3 ?討論與結(jié)論

蘭花離體開(kāi)花的研究國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的報(bào)道[2-6，8-43]。蘭科中包括蘭屬中的部分種及雜交后代（建蘭[2，4]、寒蘭[16-17]、春蘭×大花蕙蘭[6]、春劍×大花蕙蘭[41]Cymbidium niveo-marginatum Mak.[8]），石斛蘭屬中的部分種或品種（如春石斛[18-21]、鐵皮石斛[19，22]、細(xì)莖石斛[23]、金釵石斛[24]、霍山石斛[25]、疊鞘石斛[26]、報(bào)春石斛[27]、Dendrobium Madame Thong-In[28-29]、Dendrobium Sonia17[30]、Dendrobium Chao Praya Smile[31]、Friederick's Dendrobium[32]等），文心蘭屬[9]（Psygmorchis pusilla[33-34]），蝴蝶蘭屬[14] （Doritaenopsis and Phalaenopsis[32，38]），大花蕙蘭[6]，石豆蘭屬[37]，虎蛇蘭屬[39]，美冠蘭屬[42]，地寶蘭屬[43]， 五唇蘭屬（Doritis pulcherrima）與尖囊蘭屬Kingiella philippinensis[13]等幾個(gè)屬及其屬間雜交種已經(jīng)獲得了試管花。本研究結(jié)果表明，建蘭與寒蘭雜交后代的根狀莖、試管苗和根狀薄層也可以成功誘導(dǎo)形成試管花。

研究蘭花試管開(kāi)花能大大縮短蘭花在試管外從苗期到成熟開(kāi)花期的時(shí)間[36]，滿足育種者提早對(duì)花部性狀選擇的需求。要通過(guò)誘導(dǎo)試管花來(lái)加速育種進(jìn)程或者把試驗(yàn)結(jié)果商品化，就需要誘導(dǎo)出正常的花，但目前有關(guān)正常開(kāi)花率的研究還較少[23]，并且大部分蘭花的試管花誘導(dǎo)率和正常開(kāi)花率低下仍是蘭花試管開(kāi)花技術(shù)應(yīng)用的主要障礙。本試驗(yàn)結(jié)果表明，建蘭小桃紅與寒蘭的雜交后代的切根試管苗、根狀莖、根狀莖薄層的試管花誘導(dǎo)率分別為80%、61.67%和16.67%，正常開(kāi)花率分別為26.67%、12.50%和1.67%，說(shuō)明不同材料正常開(kāi)花率差異大。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)試管花需要一定的脅迫處理，過(guò)度脅迫常常導(dǎo)致花芽的畸形，因此針對(duì)根狀莖、試管苗、薄層的特點(diǎn)需采用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件才可能獲得較高的正常開(kāi)花率。

目前，對(duì)蘭花試管花形成過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察及其細(xì)胞學(xué)機(jī)理的研究報(bào)道較少[24，40]，王琳[24]認(rèn)為金釵石斛40 d有花原基出現(xiàn)，隨后出現(xiàn)萼片原基，50 d有新月形的萼片，60 d有花瓣原基出現(xiàn)，70 d形成花瓣。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)觀察蘭屬蘭花試管花的形成和發(fā)育過(guò)程，把蘭花試管花形態(tài)發(fā)生過(guò)程分為花芽誘導(dǎo)期、花芽形態(tài)建成期、開(kāi)花期和謝花期4個(gè)時(shí)期，并根據(jù)根狀莖試管花的細(xì)胞學(xué)發(fā)生過(guò)程，將試管花形成過(guò)程分為花序原基形成期、花序原基分化期、小花原基形成期和小花原基分化期4個(gè)時(shí)期，這為根據(jù)不同時(shí)期的特點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，進(jìn)一步提高正常開(kāi)花率，闡明試管花形成的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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