李龍　張蕾　張東陽　劉澤玉　徐安英　錢荷英　武國華

摘要 [目的] 探討抗性品種和非抗性品種家蠶接種家蠶核型多角體病毒（BmNPV）后體內(nèi)羧酸酯酶（CarE）和乙酰膽堿酯酶（AchE）活性的變化規(guī)律。[方法]對抗性品種及其對照品種家蠶添食BmNPV，測定并比較中腸和血液中羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的活性變化。[結(jié)果] 家蠶接種BmNPV后，抗性品種的中腸中羧酸酯酶活性上升，而對照品種羧酸酯酶活性先升高，然后從第3天開始活性降低?？剐云贩N前2 d中腸的乙酰膽堿酯酶活性降低，而對照品種與之相反。家蠶接種BmNPV后，抗性品種在第2天血液羧酸酯酶活性有所升高，此后基本保持不變，而非抗性品種在第3天羧酸酯酶活性升高后下降；抗性品種血液乙酰膽堿酯酶活性升高，對照品種前2 d乙酰膽堿酯酶升高后降低。[結(jié)論]抗性品種在感染BmNPV病毒后其中腸中羧酸酯酶活性高于未感染的抗性品種，表明抗性品種對感染病毒做出了有效應(yīng)答和防御；而在感染病毒后抗性品種的中腸與血液中乙酰膽堿酯酶活性均變化相對較小。據(jù)此推測，抗性品種在感染病毒后仍保持了相對穩(wěn)定的代謝過程。

關(guān)鍵詞 家蠶；BmNPV；羧酸酯酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號 S88 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-123-04

家蠶（Bombyx mori）是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價值的昆蟲，同時也是鱗翅目的模式生物。家蠶幼蟲易受到多種病原微生物的入侵，其中家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus， BmNPV）是養(yǎng)蠶過程中經(jīng)常遇到的也是危害巨大的一種病原體。由BmNPV侵染引起的家蠶核型多角體病毒病傳染性極強(qiáng)，死亡率高，且難以控制，可給蠶業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，一直是蠶桑產(chǎn)業(yè)的防控和研究的重點之一[1-2]。BmNPV主要在家蠶細(xì)胞核內(nèi)增殖，隨著病毒增多細(xì)胞開始核膨脹，隨后細(xì)胞膨大破裂，從而使病毒及細(xì)胞碎片游離于血液中[3]。家蠶感染病毒后會出現(xiàn)體色變?yōu)槿榘祝姑嬗绕涿黠@，刺破體皮會流出乳白色的膿汁，體節(jié)腫脹，狂躁不安，四處爬行。目前已有許多關(guān)于家蠶與BmNPV感染、抗性的研究，并培育出抗BmNPV家蠶品種投入到蠶桑生產(chǎn)中[4]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所培育的家蠶抗性品種871C×872C的半致死濃度（LC50）在10.9數(shù)量級，比對照品種高出4～5個數(shù)量級[5]。然而，家蠶對BmNPV的抗性機(jī)制至今尚不完全清楚。

一般認(rèn)為，家蠶經(jīng)口接種BmNPV感染的最初部位是中腸，且中腸是家蠶抗BmNPV的第一道防線[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶對BmNPV的抗性的第1階段可能是家蠶中腸細(xì)胞受體蛋白阻止病毒侵染家蠶細(xì)胞，第2階段可能是中腸細(xì)胞內(nèi)的某些抗病毒蛋白阻止了病毒的復(fù)制和增殖[8-10]。血液作為家蠶重要的免疫防御組織，在受到病毒入侵時也會發(fā)生相應(yīng)的變化，如通過血細(xì)胞對病毒進(jìn)行吞噬，產(chǎn)生能夠抑制或消滅病毒的物質(zhì)，從而發(fā)揮重要的防御功能[11]。病毒入侵會影響家蠶正常的生理代謝，尤其會引起其體內(nèi)多種酶活性發(fā)生變化[12-13]。羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶是家蠶體內(nèi)重要的代謝酶，與家蠶的生理狀態(tài)相關(guān)。研究表明，家蠶中腸羧酸酯酶活性與家蠶對濃核病毒的抗性有關(guān)，接種濃核病毒12 h后抗性品系中腸羧酸酯酶活力升高[14]。謝洪霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)家蠶感染BmNPV后蠶體內(nèi)羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生變化。因此，羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的活性可以反映家蠶代謝是否穩(wěn)定，用來判斷家蠶是否受到病毒侵害。但是，不同家蠶品種對BmNPV的抗性存在較大差異[16]，目前對于家蠶感染BmNPV后體內(nèi)羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性的變化規(guī)律還不明確。

筆者以新近選育的具有較強(qiáng)BmNPV抗性的家蠶品種洞庭C×碧波C為研究對象，與對照品種洞庭×碧波進(jìn)行比較研究。用5齡家蠶幼蟲經(jīng)口添食BmNPV，研究感染BmNPV后抗性品種及其對照品種之間中腸和血液中羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗BmNPV家蠶品種洞庭C×碧波C、對照品種洞庭×碧波，均由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所提供?？剐云贩N的遺傳背景與對照種99.9%相同，但帶有抗病基因。BmNPV病毒由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所病理室提供，濃度為1.0×10.9多角體/ml。

1.2 儀器與試劑

BioTek PowerWave XS2酶標(biāo)儀；法國Millipore公司Milli-Q超純水儀；乙酰膽堿酯酶測試盒，購自南京建成生物工程研究所；α-乙酸奈酯（α-NA 分析純）；α-萘酚（分析純）；固藍(lán)B鹽（分析純）；十二烷基硫酸鈉（SDS；分析純）；4-硝基苯酚棕櫚酸酯（P-NPP；分析純）；4-硝基苯酚（p-NP；分析純）；無水碳酸鈉（分析純）；無水乙醇（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸二氫鈉（分析純）。

1.3 病毒接種及樣品制備

抗性品種和對照品種家蠶飼養(yǎng)至5齡，分別分為2組，其中1組在5齡起蠶時經(jīng)口添食接種BmNPV病毒液，每頭添食10 μl，另1組作為正常對照。4種處理（抗性品種接種病毒、抗性品種正常、對照品種接種病毒、對照品種正常），每24 h取1次中腸和血液，至添毒后第5天，將采集血液于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液保存，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 家蠶體內(nèi)酶活性的測定

①酶液制備：中腸組織用冰冷的0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）2 ml作為提取液研磨勻漿，勻漿液于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液作為中腸酶液。

②羧酸酯酶活性的測定方法參照Van Asperen法[17-18]。取稀釋10倍的中腸酶液10 μl或稀釋10倍的血液30 μl，加入3 ml 0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）及0.5 ml 3×10-4 mol/L α-乙酸奈酯液（用0.04 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制），37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，加入50 μl顯色劑（1%固藍(lán)B鹽和5%SDS按2∶5混合），室溫下放置10 min后于600 nm處測定吸光度。用0.04 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液作空白調(diào)零，通過建立α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶液中羧酸酯酶活性。在上述試驗條件下，以每分鐘水解α-乙酸奈酯產(chǎn)生1 nmol α-萘酚所需的酶量定為1個酶活力單位。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。③乙酰膽堿酯酶活性測定使用乙酰膽堿酯酶測試盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 中腸2種酶活性的變化

2.1.1 中腸羧酸酯酶活性的變化。

測定了抗性品種及其對照品種5齡家蠶添食BmNPV第1～5天中腸羧酸酯酶活性。從圖1可以看出，抗性家蠶接種第2天開始比未接種BmNPV的家蠶羧酸酯酶活性明顯升高。對照品種家蠶接種BmNPV后第1、2天與正常對照品種家蠶相比羧酸酯酶活性明顯增強(qiáng)，但第3、4、5天羧酸酯酶活性明顯降低。

2.1.2 中腸乙酰膽堿酯酶活性的變化。

測定了抗性品種及對照品種5齡家蠶添食BmNPV第1～5天中腸乙酰膽堿酯酶活性。從圖2可以看出，抗性品種在接種BmNPV病毒后其活性并未發(fā)生較大變化。對照品種在接種BmNPV后第1、2天乙酰膽堿酯酶活性明顯高于未接種家蠶，而第3～5天乙酰膽堿酯酶活性明顯低于未接種家蠶，這種變化趨勢和對照品種接種BmNPV后中腸中羧酸酯酶活性變化規(guī)律基本一致。

2.2 血液中2種酶活性的變化

2.2.1 血液羧酸酯酶活性的變化。

測定了抗性品種及對照品種家蠶5齡添食BmNPV第1～5天血液羧酸酯酶活性。從圖3可以看出，正常品種在接種病毒后，除第3天以外血液中羧酸酯酶活力均低于正常對照品種?？剐云贩N在接種病毒后，第1、3、4、5天血液中的羧酸酯酶活性與正常抗性品種差距不大，而第2天羧酸酯酶活性要高于正?？剐云贩N。另外，血液中的羧酸酯酶活性要遠(yuǎn)低于中腸中的羧酸酯酶活性。

2.2.2 血液乙酰膽堿酯酶活性的變化。

測定了抗性品種及對照品種家蠶5齡添食BmNPV第1～5天血液乙酰膽堿酯酶活性。從圖4可以看出，抗性品種家蠶接種病毒后第1～4天血液乙酰膽堿酯酶均高于正?？剐云贩N，而第5天活性低于正?？剐云贩N；對照品種家蠶在接種病毒后前2天血液乙酰膽堿酯酶高于正常對照品種，但第3～5天活性均低于正常對照品種。從結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)，在1～5天的飼養(yǎng)過程中接種病毒的抗性品種，相對于未接種病毒的品種其乙酰膽堿酯酶的活性變化幅度并不顯著，而對照品種接種病毒后其乙酰膽堿酯酶活性波動幅度較大。

3 討論

在家蠶感染BmNPV的研究中，一般將BmNPV在蠶體內(nèi)的增殖大體分為4個時期[19-20]： 接種后36 h內(nèi)的隱潛期、接種后36～60 h的緩慢增殖期、接種后64～84 h的高速增殖期以及接種84 h以后的穩(wěn)定增殖期。一般鱗翅目昆蟲經(jīng)口感染NPV后，中腸組織的細(xì)胞先被感染，然后再蔓延到其他組織，進(jìn)入血淋巴最后導(dǎo)致昆蟲死亡[21-22]。筆者選用的家蠶品種是抗病品種洞庭C×碧波C和其對照品種洞庭×碧波，這2種家蠶除了理論上存在抗性基因差異外，其余99.9%的遺傳背景是相同的。在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，對照品種接種BmNPV后第3天血液開始出現(xiàn)渾濁，到第5天所有對照品種家蠶都呈現(xiàn)體色發(fā)白，腹面部尤其明顯，且血液成乳白濃稠狀態(tài)。這說明對照品種染病明顯，而抗性品種接種病毒后無此現(xiàn)象，表明此抗性品種確實對BmNPV具有很好的抗性。

國內(nèi)外研究表明，羧酸酯酶能有效地催化水解酯類和酰胺類化合物，參與多種藥物、環(huán)境毒物及致癌物的解毒和代謝，并與脂質(zhì)的運輸和代謝有關(guān)[23]，同時它們也是昆蟲與抗性相關(guān)的重要解毒代謝酶。乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶，其活性變化能夠反映出細(xì)胞的代謝狀態(tài)。如果乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生較大變化，也預(yù)示著家蠶的整個代謝及生理過程受到了較大的干擾和影響。

在試驗過程中，由于中腸是家蠶最先接觸病毒感染的組織，因此中腸內(nèi)酶活性的變化更能反映BmNPV對家蠶生理狀態(tài)的影響。通過對抗性品種和對照品種接種BmNPV后中腸羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的活力測定和比較，發(fā)現(xiàn)抗性品種接種病毒后羧酸酯酶活性均高于正?？剐云贩N，而對照品種接種BmNPV后第1、2天羧酸酯酶活性明顯高于正常對照品種，第3～5天羧酸酯酶活性明顯低于正常對照品種。對照品種在接種第3天羧酸酯酶活性發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，推測這可能與BmNPV的感染有關(guān)，病毒入侵后導(dǎo)致對照品種在感染第2、3天中腸細(xì)胞大量破裂，BmNPV擴(kuò)散至血液等其他組織。試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，對照品種接種BmNPV第3天血液開始變渾濁，說明細(xì)胞破裂，病毒與細(xì)胞碎片游離于血液中。這說明中腸羧酸酯酶活力提高可能與家蠶對BmNPV的抗性有關(guān)，也可能還與BmNPV的感染刺激有關(guān)，這與謝洪霞[15]等的研究結(jié)果病毒感染后蠶體內(nèi)羧酸酯酶活性升高相似。從乙酰膽堿酯酶的活性來看，抗性品種接種病毒后中腸中乙酰膽堿酯酶活性波動較小，說明抗性品種的代謝過程所受的影響較小，家蠶保持了相對穩(wěn)定的生活狀態(tài)；對照品種接種病毒后，其乙酰膽堿酯酶活性波動較大，這可能與BmNPV病毒感染造成的細(xì)胞破裂，家蠶的代謝過程受到嚴(yán)重干擾有關(guān)。

抗性品種和非抗性品種在接種病毒后第1天血液羧酸酯酶活性均有所下降，可能與病毒侵染有關(guān)，但抗性品種在接種第2天血液羧酸酯酶活性升高后活性基本保持不變，這可能是由于抗性品種對BmNPV產(chǎn)生抗性所致，使BmNPV沒有繼續(xù)侵染或延緩了BmNPV的侵染。非抗性品種在接種第3天羧酸酯酶活性升高之后活性明顯下降，這可能與對照品種受到病毒感染有關(guān)。另外，在感染病毒后抗性品種血液中的乙酰膽堿酯酶并未受到顯著影響，其活性保持了相對穩(wěn)定的狀態(tài)；受到病毒感染后，對照品種家蠶的乙酰膽堿酯酶活性波動較大，在感染后第2天對照品種血液中乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生了顯著升高，這與對照品種感染后第2天中腸中乙酰膽堿酯酶活性升高有一定對應(yīng)性，它也預(yù)示著家蠶的正常生理活動與代謝過程受到了嚴(yán)重影響。

參考文獻(xiàn)

[1]浙江大學(xué). 家蠶病理學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2001： 36-53.

[2] 黃桂輝， 黎明， 李堯方. 家蠶病毒病的發(fā)病規(guī)律及綜合防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2012（17）： 266-274.

[3] 呂鴻聲.昆蟲病毒分子生物學(xué)[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)科技出版社， 1998： 1-15.

[4] 李木旺. 家蠶抗核型多角體病毒病、濃核病的種質(zhì)創(chuàng)新及RAPD分子標(biāo)記的研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2001.

[5] 李文學(xué)， 青學(xué)剛， 劉俊鳳， 等. 家蠶品種871C×872C對BmNPV抗性鑒定研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2011， 24（2）： 779-781.

[6] CORY J S， MYERS J H. The ecology and evolution of insect baculoviruses[J]. Annu Rev Ecol Syst， 2003， 34： 239-272.

[7] RAHMAN M M， GOPINATHAN K P. Systemic and in vitroinfection process of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus[J]. Virus Research， 2004， 101（2）： 109-118.

[8] KANGAYAM M P， HIROSHI N， SEIICHI F， et a1. A lipase isolated from the silkworm Bombyx mori shows antiviral activity against nucleopolyhedrovirus[J]. Journal of Virology， 2003， 77： 10725-10729.

[9] HIROSHI N， EIKO T， KANGAYAN M P， et a1. Antiviral activity of a serine protease from the digestive juice of larvae against nucleopolyhedrovirus [J]. Virology， 2004， 321： 154-162.

[10] 姚慧鵬， 何芳青， 郭愛芹， 等. 中國野桑蠶抗病毒蛋白基因（Lipase）的克隆與活性鑒定[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2008， 34（3）： 466-471.

[11] 呂鴻聲. 昆蟲免疫學(xué)原理[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2008： 97-123.

[12] 劉震， 鮑先巡， 尤征英， 等. 家蠶對BmNPV抗病性與中腸消化酶活性的關(guān)系[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2009， 36（3）： 489-492.

[13] BABU K R， RAMAKRISHNA S， REDDY Y H K， et a1. Metabolic alterations and molecular mechanism in silkworm larvae during viral infection： A review[J]. Afr J Biotechnol， 2009， 8（6）： 899-907.

[14] 高貴田， 陳克平， 姚勤， 等. 抗?jié)夂瞬《局袊昙倚Q品系中腸羧酸酯酶活力變化和基因表達(dá)差異的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 40（5）： 1042-1049.

[15] 謝洪霞， 涂增， 萬永繼， 等. 不同飼料飼養(yǎng)對家蠶抗核型多角體病毒的能力以及體內(nèi)3種代謝酶活性的影響[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2009， 35（3）： 642-647.

[16] 陳克平， 林昌麒， 姚勤. 家蠶對核型多角體病的抗性及遺傳規(guī)律的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 1996，22（3）：160-164.

[17] ASPEREN K V. A study of housefly esterases by mean of asensifive colorimetric method[J]. Jins Physiol， 1962， 8： 401-406.

[18] THOMAS V. Comparison of lipases by different assays[J]. Enzyme Microbiology Technology， 1992，14： 631-635.

[19] 徐家萍， 劉明輝， 孫帆. 家蠶核型多角體病的抗性機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國蠶業(yè)， 2006， 27（2）： 8-14.

[20] 華南農(nóng)業(yè)大學(xué). 蠶病學(xué)[M]. 2版.北京： 農(nóng)業(yè)出版社，1993： 5-21.

[21] ENGELHARD E K， VOLKMAN L E. Developmental resistance in fourth instar Trichoplusia niorally inoculated with Autographa californicaM nuclear polyhedrosis virus[J]. Virology， 1995， 209： 384-389.

[22] KIRKPATRICK B A， WASHBURN J O， VOLKMAN L E. AcMNPV pathogenesis and developmental resistance in fifth instarHeliothis virescens[J]. J Invertebr Pathol， 1998， 72： 63-72.

[23] 滕霞， 孫曼霽. 羧酸酯酶研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)， 2003， 15（1）： 31-35.