陳安徽　邵穎　李繼武　韓富海

摘要[目的]在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過(guò)程中添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）和3-吲哚乙酸2種激素以考察激素對(duì)蟬擬青霉代謝途徑的影響。[方法]在蟬擬青霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照5 mg/L的比例添加激素6-芐氨基嘌呤和3-吲哚乙酸，研究激素對(duì)蟬擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中生物量、胞內(nèi)總核苷和腺苷合成的影響。[結(jié)果]2個(gè)試驗(yàn)組在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)代謝節(jié)奏與對(duì)照組間存在一定差異；6-BA試驗(yàn)組和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組蟬擬青霉于發(fā)酵第3天達(dá)到最大生物量，分別為6.135 g/L和5.860 g/L，比對(duì)照組分別提高了19.10%和13.76%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而且試驗(yàn)組比對(duì)照組提前24 h達(dá)到最大值；6-BA試驗(yàn)組和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)總核苷最高含量分別達(dá)到18.49 mg/g和16.77 mg/g，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），比對(duì)照組分別提高了65.24%和49.87%；6-BA試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷含量于發(fā)酵第4天達(dá)到最大值2.32 mg/g，3-吲哚乙酸試驗(yàn)組于第3天達(dá)到最大值1.82 mg/g，對(duì)照組于發(fā)酵第4天胞內(nèi)腺苷含量達(dá)到最大值1.75 mg/g，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)6-BA試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷最高含量顯著高于3-吲哚乙酸試驗(yàn)組和對(duì)照組（P<0.05）。[結(jié)論]2種激素在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過(guò)程中的添加對(duì)于提高蟲(chóng)草相關(guān)制品品質(zhì)發(fā)揮了積極作用，同時(shí)也說(shuō)明激素確實(shí)會(huì)改變微生物的代謝途徑及生長(zhǎng)節(jié)奏。

關(guān)鍵詞 蟬擬青霉；激素；液體發(fā)酵；核苷

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）11-024-03

蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）隸屬麥角菌科（Clavicepitaceae）蟲(chóng)草屬（Cordyceps），又名雌蟬花、蟬棒束孢（Isaria cicadae），是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材蟬花（Corcyceps sobolifera）的分生孢子即無(wú)性型階段[1-4]。研究表明，蟬擬青霉的人工發(fā)酵培養(yǎng)物中含有多種與天然野生蟬花相同的活性成分，有些活性成分的含量甚至高于野生蟬花及同屬的冬蟲(chóng)夏草。李瑞雪等[5]采用反相高效液相色譜法對(duì)蟬擬青霉RCEF1081人工發(fā)酵菌絲體中的活性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中蟲(chóng)草素和鳥(niǎo)苷含量是冬蟲(chóng)夏草的2.8倍。葛飛等[6]通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蟬擬青霉RCEF0943菌株液體發(fā)酵菌絲體中的腺苷含量顯著高于野生蟬花。核苷類物質(zhì)特別是腺苷是蟲(chóng)草屬真菌的主要功能性活性成分，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的不同生理過(guò)程、抑制中樞神經(jīng)元的興奮性、增加冠狀動(dòng)脈血流量、降血壓、減慢心率及抗腫瘤等重要的生理作用[7-10]?，F(xiàn)代研究表明激素對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)產(chǎn)生特定的影響[11-12]。

筆者以6-芐氨基嘌呤（6-BA）和3-吲哚乙酸為考察對(duì)象，探索2種激素對(duì)蟬擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)及胞內(nèi)總核苷、胞內(nèi)腺苷合成的影響，為人工蟲(chóng)草資源的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種與試劑。菌種：蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）菌種保存于食品工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。試劑：3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、腺苷、尿苷、胞苷、鳥(niǎo)苷標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司； 95%乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基。

固體斜面培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%、瓊脂2%；種子培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%；液體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%。

1.1.3 儀器與設(shè)備。梅特勒電子天平，AE200型，上海分析儀器廠； 手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ.SG4﹨.280，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司； Freeze Dry Systems（冷凍干燥系統(tǒng)），040520111G，美國(guó)LABCONCO公司； SENCO R-502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)公司； 高效液相色譜儀LC3100，安徽皖儀科技股份有限公司； 高效液相色譜紫外檢測(cè)器UV3100，安徽皖儀科技股份有限公司； 分析柱Synergi Hydro（4.6 mm×250 mm，4 μm），美國(guó)Waters公司； 超凈工作臺(tái)，AIR TECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司； 光照培養(yǎng)箱，LRH-250-G，廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的發(fā)酵方法。

6-BA、3-吲哚乙酸按照5 mg/L的添加比例添加到裝有200 ml液體培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，另配制不添加激素的培養(yǎng)基。于3種培養(yǎng)基中分別按照10%的接種量接種蟬擬青霉液體種子，25 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)并定期測(cè)定生物量及胞內(nèi)核苷含量，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 生物量的測(cè)定及菌絲體的獲得。菌種培養(yǎng)過(guò)程中，每隔24 h取樣，獲得的發(fā)酵醪液抽濾后用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體5次，菌絲體冷凍干燥后準(zhǔn)確稱重。按照下式計(jì)算生物量，干燥菌絲體粉碎過(guò)100目篩，備胞內(nèi)核苷含量的檢測(cè)。

1.2.3 胞內(nèi)總核苷含量的檢測(cè)。

準(zhǔn)確稱取腺苷、尿苷、鳥(niǎo)苷、胞苷標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g定容至100 ml，得到4種標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度均為1 mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液稀釋并配制成0.002、0.004、0.006、0.008、 0.010 mg/ml的溶液，采用分光光度計(jì)法測(cè)定溶液吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入25 ml容量瓶并定容。將溶液再稀釋為0.04 mg/ml后以75%的乙醇作為空白對(duì)照測(cè)定溶液吸光值。

1.2.4 胞內(nèi)腺苷含量的檢測(cè)。

腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g置于10 ml容量瓶中，用65%的乙醇定容至刻度；將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/ml的溶液進(jìn)行HPLC分析并繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品檢測(cè)：稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入25 ml容量瓶并定容。溶液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后得樣品液，樣品液經(jīng)適當(dāng)稀釋進(jìn)行HPLC分析。

高效液相色譜條件：0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液為A液，甲醇為B液，洗脫梯度設(shè)置為：100%A液5 min、80%A液+20%B液5 min、60%A液+40%B液20 min、100%B液10 min、100% A 液10 min；流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃，UV 檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析采用DPS（V3.01）專業(yè)版數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬擬青霉的生物量由圖1可知，在該試驗(yàn)條件下，6-BA和3-吲哚乙酸均有促進(jìn)蟬擬青霉菌絲體合成的作用。其中6-BA試驗(yàn)組的最大生物量為6.135 g/L，3-吲哚乙酸組的最大生物量為5.860 g/L，空白對(duì)照組最大生物量為5.151 g/L，2實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比最大生物量分別提高了19.10%和13.76%，方差分析表明，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

由圖1還可知，6-BA和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組蟬擬青霉的最大生物量比對(duì)照組提前1 d到達(dá)，很大程度上縮短了蟬擬青霉的發(fā)酵周期。

2.2 胞內(nèi)總核苷含量的變化以各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值為縱坐標(biāo)，總核苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程為Y=39.35X+0.027 1，R2=0.992 2，線性范圍為0.002～0.010 mg/ml，胞內(nèi)總核苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

由表1可知，試驗(yàn)組和對(duì)照組均在發(fā)酵第3天時(shí)胞內(nèi)總核苷含量達(dá)到最大值。在發(fā)酵前期，2種激素并未對(duì)核苷含量產(chǎn)生影響，但在發(fā)酵第3天激素刺激蟬擬青霉胞內(nèi)核苷急劇累積，6-BA和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)總核苷含量分別達(dá)到最大值18.49 mg/g和16.77 mg/g，比對(duì)照組的最高含量11.19 mg/g分別提高了65.24%和49.87%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)試驗(yàn)組胞內(nèi)核苷的最高含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。另外，6-BA試驗(yàn)組在第3天總核苷量達(dá)到最高，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行總核苷含量迅速降低，而3-吲哚乙酸試驗(yàn)組在發(fā)酵第3天胞內(nèi)核苷含量達(dá)到最高后并未隨著發(fā)酵過(guò)程的推移出現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)。

2.3 胞內(nèi)腺苷含量的變化以不同質(zhì)量濃度的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC峰面積進(jìn)行回歸分析，得到腺苷含量的回歸方程為Y=14.931X-82.34，R2=0.998 6，線性范圍為0.025～0.200 mg/ml。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。對(duì)各組樣品進(jìn)行胞內(nèi)腺苷含量的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，6-BA和3-吲哚乙酸均對(duì)蟬擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)腺苷的合成產(chǎn)生一定的影響。3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷含量較6-BA組和對(duì)照組提前24 h達(dá)到最大值。6-BA顯著提高了胞內(nèi)腺苷的含量，最高含量達(dá)到2.32 mg/g，比對(duì)照組和3-吲哚乙酸試驗(yàn)組胞內(nèi)腺苷的最高含量分別提高了32.57%和27.47%。6-BA更有利于蟬擬青霉胞內(nèi)腺苷的合成。

3 討論

隨著天然蟲(chóng)草資源的枯竭，蟲(chóng)草已遠(yuǎn)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。蟲(chóng)草無(wú)性型菌株液體發(fā)酵菌絲體作為天然蟲(chóng)草資源的代用品越來(lái)越得到人們的追捧。蟲(chóng)草菌株的液體發(fā)酵及活性物質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明植物激素和動(dòng)物激素均可調(diào)控微生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，激素作為有效的基因開(kāi)關(guān)可以促進(jìn)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)及物質(zhì)的合成。該研究在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過(guò)程中添加6-BA和3-吲哚乙酸2種激素以考察激素對(duì)蟬擬青霉代謝途徑的影響。該試驗(yàn)條件下，向蟬擬青霉液體培養(yǎng)基中按照5 mg/L的比例添加6-BA和3-吲哚乙酸，發(fā)現(xiàn)2種激素對(duì)蟬擬青霉生物量、胞內(nèi)總核苷和胞內(nèi)腺苷的含量均產(chǎn)生了一定的影響。6-BA與3-吲哚乙酸組生物量較對(duì)照組提前1 d達(dá)到最大值，大大縮短了蟬擬青霉的發(fā)酵周期，同時(shí)2種激素也促進(jìn)了胞內(nèi)總核苷和腺苷的合成。腺苷是蟲(chóng)草屬真菌的主要活性成分之一，目前已作為檢測(cè)蟲(chóng)草類制品質(zhì)量的重要質(zhì)控指標(biāo)，2種激素在蟬擬青霉液體深層發(fā)酵過(guò)程中的添加對(duì)于提高蟲(chóng)草相關(guān)制品品質(zhì)發(fā)揮了積極作用，同時(shí)也說(shuō)明激素確實(shí)會(huì)改變微生物的代謝途徑及生長(zhǎng)節(jié)奏。至于激素對(duì)蟬擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生其他活性成分的影響程度及激素不同添加量對(duì)活性物質(zhì)累積的影響有待于進(jìn)一步研究。

激素在蟬擬青霉液體發(fā)酵過(guò)程中的添加可以縮短發(fā)酵周期，提高胞內(nèi)總核苷和腺苷的含量。該研究的開(kāi)展將為蟬花有效代用品的開(kāi)發(fā)提供途徑，為蟲(chóng)草資源的有效應(yīng)用提供參考。

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