張楨 孫幫燕 郭貴唐 羅建蓉

摘要[目的]為了分析華山松松塔提取物抗HIV活性部位中鉛含量。[方法] 應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法，參照中華人民共和國藥典2010版[附錄Ⅸ B 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（一部）]測定活性部位中鉛含量。[結(jié)果]活性部位中鉛含量在中華人民共和國對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》和《中國藥典》規(guī)定范圍（Pb≤5.0 mg/kg ）之內(nèi)，沒有超標(biāo)。[結(jié)論]該方法簡單、方便、快速、靈敏，為抗HIV活性部位重金屬鉛含量測試提供一種可靠的方法。

關(guān)鍵詞 含量測定； 鉛； 抗HIV活性部位；華山松； 石墨爐原子吸收光譜法

中圖分類號(hào) S791.241文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2015）11-001-02

病原體為人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）的疾病，臨床上稱其為獲得性免疫缺陷綜合癥（Acquiredimmune deficiency syndrome/AIDS）。如果機(jī)體感染HIV，那么機(jī)體的免疫細(xì)胞功能將會(huì)衰退且免疫細(xì)胞數(shù)量會(huì)衰退，導(dǎo)致機(jī)體增加惡性腫瘤發(fā)生機(jī)率或感染，最終導(dǎo)致感染者死亡。HIV不僅嚴(yán)重威脅著人類的健康，而且阻礙全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展[1]。目前，盡管美國批準(zhǔn)上市的HIV的藥物有20多種，但是價(jià)格昂貴、毒副作用大，作用環(huán)節(jié)單一，易出現(xiàn)耐藥性[2-3]。

松科松屬植物資源豐富，全世界約100多種。我國松屬植物分布極廣，合計(jì)50余種（有22種，10個(gè)變種，引進(jìn)16種，2個(gè)變種）[4]。據(jù)《本草綱目》記載，松塔具有祛痰、祛風(fēng)、止咳平喘、安神和潤腸等功效[5]。在我國，已有13種被列入藥用的松屬植物，其能入藥部位主要為松塔及松子、松針、松脂、松節(jié)等。從目前松塔研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，松塔中含有多糖、酚類、木質(zhì)素類、萜類、黃酮類多種化學(xué)成分，且發(fā)現(xiàn)松塔藥理活性具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫力等作用[6-8]。

盡管中華人民共和國藥典把13種松屬植物列入藥用，但目前報(bào)道松屬的松塔藥用開發(fā)不是很多，尤其關(guān)于松塔抗HIV藥用的研究報(bào)道很少[9]。為此，筆者對(duì)采集于云南省巍山縣的華山松（Pinus armandii Franch.）松塔進(jìn)行研究，測定松塔提取物中（抗HIV治療指數(shù)>30）鉛的含量，為進(jìn)一步研究抗HIV藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取干燥的華山松（P. armandii Franch.）松塔（生藥學(xué)馬曉寬教授鑒定）5 kg，粉碎，用一定濃度的乙醇（90%）在室溫條件下提取2次（2×9 L），每次12 h。過濾，殘?jiān)盟萏崛?，過濾后殘?jiān)屑訅A液（濃度4%氫氧化鈉）浸泡提取，過濾，向得到的堿性濾液加入酸（用乙酸調(diào)pH），濃縮到適量體積，加入乙醇混勻，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅰ；在濾液中繼續(xù)加醇液，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅱ；濾液中再加醇液，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅲ。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1測定條件。波長為283.1 nm[5]；背景校正為塞曼效應(yīng)；狹縫0.7 nm；樣品進(jìn)樣量17 μl，0.5%基體改進(jìn)劑硝酸鎂和硝酸鈀的混合液3 μl，高純氬氣為保護(hù)氣（250 ml/min）。升溫程序（表1）： 第1次干燥溫度110 ℃， 坡升時(shí)間1 s， 持續(xù)時(shí)間30 s；第2次干燥溫度130 ℃， 坡升時(shí)間15 s， 持續(xù)時(shí)間30 s；灰化溫度850 ℃，坡升時(shí)間10 s，持續(xù)時(shí)間20 s；原子化溫度1 600 ℃，坡升時(shí)間0 s，持續(xù)5 s；凈化溫度2 450 ℃，坡升時(shí)間1 s，持續(xù)時(shí)間3 s。

1.2.2鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備。

精密量取鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)液（GB08619）適量，用濃度2%硝酸溶液稀釋，即得1 μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冰箱中0～5 ℃保存[5]。精密量取鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量， 用濃度2%硝酸溶液稀釋，配制400 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液（用時(shí)現(xiàn)配）。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。 分別精密量取鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 ml于25 ml容量瓶中，用濃度2%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得0、5、10、20、40、80、160 ng/ml的溶液。按“1.2.1”用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣，于石墨爐原子吸收光譜儀上測試?？鄢噭┛瞻?，以吸光度值（A）對(duì)鉛濃度（C， ng /ml）做線性回歸處理，回歸方程為：A=0.002 85C+0.003 93，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 0，線性范圍為0～200 ng/ml。

1.2.4樣品測定。

參照中華人民共和國藥典[2010版附錄Ⅸ B 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（一部）（B法）]處理標(biāo)本[5]，分別精密稱取3種抗HIV活性部位（治療指數(shù)>30）[4]樣品0.20g，置三角瓶中，加硝酸/高氯酸（4∶1）10 ml，瓶口加一小漏斗，浸泡過夜，在通風(fēng)廚里置電熱板上加熱消解，保持微沸，直至濃煙散盡，消解液呈透明，再加去離子水，待白煙散盡，定容至25 ml。同時(shí)，制備空白液，按測定條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1精密度試驗(yàn)。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，重復(fù)測定吸光度6次。表2表明，樣品Ⅰ～ⅢRSD分別為1.50%、1.77%、1.53%，說明該方法精密度良好。

2.1.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“ 1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，每隔20 min測定一次吸光度。表3表明，2 h內(nèi)顏色變化較小，不影響測定。

2.1.3回收率試驗(yàn)。采用加標(biāo)回收法，取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，加入 0.5～2.0倍標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，測定其吸光度，并且計(jì)算回收率。表4表明，平均回收率為99.79%，RSD為4.45%。

2.1.4方法檢出限。參照中華人民共和國對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[10]，該法檢出限為5.0 μg/kg。

2.1.5評(píng)價(jià)結(jié)果。采用《中國藥典》[5]（2010年版）和中華人民共和國對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[10]重金屬最高限定的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。

結(jié)果表明，提取物Ⅰ～Ⅲ 鉛含量分別為3.41、2.71、2.92 mg/kg，低于中華人民共和國對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（Pb≤5.0 mg/kg）和《中國藥典》（2010年版）重金屬最高限定的標(biāo)準(zhǔn)（Pb≤5.0 mg/kg）；超標(biāo)率為0。

3 討論

在取樣和樣品消解過稱中，所有玻璃儀器均需以16.67%硝酸浸泡過夜，用水反復(fù)沖洗，最后用去離子水沖洗，以免污染試樣。石墨爐原子吸收光譜分析法是一種靈敏度高、適合測定鉛的測試技術(shù)，但是存在基體干擾嚴(yán)重等缺點(diǎn)，故在石墨爐原子吸收分光光度分析工作中，應(yīng)注意背景和其他原因引起的對(duì)測定結(jié)果的干擾。如，儀器工作原子化條件可能影響儀器的靈敏度、穩(wěn)定程度。試驗(yàn)中，選擇塞曼效應(yīng)為背景校正系統(tǒng)[7]。該研究表明，濃度0.5%硝酸鎂和硝酸鈀是一種良好的基體改進(jìn)劑，因此在校準(zhǔn)曲線和標(biāo)本測試過程中，設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器同時(shí)加入改進(jìn)劑，就可以滿足測定需要，減少測試步驟，避免基體干擾測試結(jié)果。按提取工藝對(duì)采自于云南省巍山縣的華山松（Pinus armandii Franch.）松塔進(jìn)行處理，得到抗HIV活性部位鉛含量沒有超標(biāo)。

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責(zé)任編輯 劉月娟 責(zé)任校對(duì) 李巖