陳嬌　孫長(zhǎng)君　楊昭　王朝政　李奕星　李芬芳　袁德保　譚琳　仇厚援　陳文學(xué)　金志強(qiáng)

摘 要 筆者所在課題組從巴西香蕉中分離到1個(gè)PPO基因全長(zhǎng)，并進(jìn)行了原核表達(dá)，但結(jié)果未表達(dá)出目的蛋白。鑒于上述情況，筆者對(duì)香蕉PPO全蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)移肽分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其N端含有轉(zhuǎn)移肽，長(zhǎng)度為47個(gè)氨基酸。切除轉(zhuǎn)移肽并進(jìn)行香蕉PPO成熟蛋白原核表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，在62 ku處有一條特異的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)大小相符；并且進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果確定重組表達(dá)蛋白為香蕉PPO，初步說明轉(zhuǎn)移肽對(duì)香蕉PPO體外表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐變生理和調(diào)控機(jī)制中的作用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 香蕉；多酚氧化酶；轉(zhuǎn)移肽；成熟蛋白；原核表達(dá)

中圖分類號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Prokaryotic Expression of Polyphenol Oxidase Mature

Protein from Banana（Musa acuminate）

CHEN Jiao1， SUN Changjun1*， YANG Zhao2， WANG Chaozheng1， LI Yixing1， LI Fenfang1，

YUAN Debao1**， TAN Lin1**， CHOU Houyuan2， CHEN Wenxue2， JIN Zhiqiang1

1 Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key

Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou， Hainan 570102， China

2 Institute of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract A full-length PPO gene was isolated from banana， and the prokaryotic expression of this full-length gene was not succeeded. A 47 amino acids length transit peptide in its N-terminus was predicted by further amino acid sequence analysis. Prokaryotic expression of mature PPO protein without the transit peptide was performed. SDS-PAGE electrophoresis results showed a 62 ku specific protein bands with the expected size， and mass spectrometry analysis results showed that the recombinant protein was banana PPO. The results indicated that the transfer peptide may affect banana PPO expression in vitro， and lay some theory foundation to study the functions of banana PPO and its role in banana browning physiology and regulatory mechanisms.

Key words Banana；Polyphenol oxidase；Transit peptide；Mature protein；Prokaryotic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.015

香蕉（Musa acuminate）是世界最重要的水果之一，同時(shí)在一些經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的國(guó)家也作為一種重要糧食作物[1-2]。然而香蕉自身非常容易褐變，褐變不僅影響了香蕉的外觀品質(zhì)，而且破壞了香蕉的質(zhì)地結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值成分降低，從而嚴(yán)重限制香蕉加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。人研究結(jié)果表明，多酚氧化酶引起的酶促褐變是香蕉褐變的主要原因[3-4]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一類廣泛存在于動(dòng)植物、真菌及細(xì)菌中的含銅質(zhì)體金屬酶[5-6]。廣義上PPO可分為3大類：兒茶酚氧化酶、漆酶和酪氨酸酶[7]。PPO在生物體內(nèi)色素合成及酶促褐變過程中起關(guān)鍵的作用[5，8-9]。因此，對(duì)香蕉PPO及其基因的研究具有巨大的理論和應(yīng)用價(jià)值[10]。

目前，對(duì)香蕉PPO的研究主要集中在酶學(xué)特性、分離純化、活性抑制等方面，對(duì)香蕉PPO基因的研究仍非常有限，主要是關(guān)于香蕉PPO基因部分序列擴(kuò)增及香蕉果皮褐變與PPO基因表達(dá)量關(guān)系的研究[11-15]，但體外表達(dá)香蕉PPO基因的研究至今未見報(bào)道?；虻捏w外表達(dá)對(duì)研究其所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其實(shí)際應(yīng)用都十分重要[16]。根據(jù)外源基因表達(dá)的宿主不同，可將表達(dá)系統(tǒng)大致分為2類：原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠目前研究最清楚的表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)現(xiàn)有大量研究結(jié)果表明，大部分植物PPO定位于質(zhì)體膜上，需要經(jīng)翻譯后加工才能獲得酶活。首先，含有轉(zhuǎn)移肽（導(dǎo)肽）的前體PPO在核基因的控制下，在細(xì)胞質(zhì)中合成，然后轉(zhuǎn)移肽引導(dǎo)前體PPO進(jìn)入葉綠體，而在PPO被引導(dǎo)進(jìn)入質(zhì)體后導(dǎo)肽則被切除。最后，PPO再經(jīng)過一定的折疊等翻譯后加工，而成為獲得活性的成熟PPO[17]。

為了進(jìn)一步深入研究香蕉PPO的結(jié)構(gòu)與功能，并明確其與香蕉果皮褐變的關(guān)系。本研究將對(duì)未能成功表達(dá)的香蕉PPO全蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)移肽分析、切除，然后再進(jìn)行香蕉成熟PPO原核表達(dá)，以期能夠成功獲得香蕉PPO成熟蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉PPO基因全長(zhǎng)由本實(shí)驗(yàn)室自主克隆獲得且已在GenBank登錄（登錄號(hào)：KF900300.1），并且已構(gòu)建香蕉PPO全蛋白原核表達(dá)載體pQE80L - MaPPO1（含轉(zhuǎn)移肽）。載體質(zhì)粒pQE80L、感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站保存。宿主菌 E. coli M15為暨南大學(xué)姚占娟博士惠贈(zèng)。Taq DNA聚合酶、pMD19-T、KpnⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、DNA marker購(gòu)自TaKaRa 公司；Blue Plus Protein Marker（DM101）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Folin-酚試劑（SK5031）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購(gòu)自BBI公司；瓊脂糖金屬螯合介質(zhì)購(gòu)自國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心；其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 香蕉PPO全蛋白轉(zhuǎn)移肽位置的分析 利用CBS網(wǎng)站上的TargetP 1.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/psort）和ChloroP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）在線預(yù)測(cè)香蕉PPO全蛋白導(dǎo)肽位點(diǎn)和導(dǎo)肽形式，分析并確定香蕉 PPO 轉(zhuǎn)移肽的位置，為成熟蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

1.2.2 香蕉PPO成熟蛋白基因克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建 通過軟件ChloroP 1.1 Server在線預(yù)測(cè)，確定轉(zhuǎn)移肽的位置，并將切除轉(zhuǎn)移肽后的蛋白命名為MaPPO533，對(duì)應(yīng)的基因命名為MaPPO533。根據(jù) MaPPO533基因全長(zhǎng)cDNA序列及pQE80L載體多克隆位點(diǎn)分析，在上下游引物上引入KpnⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)（上游引物：5′- CGGggtaccCCGat

gactgcaaatgccaagctcgac-3′，下游引物：5′-CCCaagc

ttGGtcaatt tgggaaatcgat-3′，下劃線為酶切位點(diǎn)）。以香蕉全蛋白pQE80L-MaPPO1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后回收，與pQE80L質(zhì)粒分別進(jìn)行KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后按一定分子比進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序等驗(yàn)證。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取鑒定正確的陽(yáng)性克隆單菌落接種至同時(shí)含有氨芐（Amp，50 μg/mL）和卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜震蕩培養(yǎng)；再按1 ∶ 100的比例同樣接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)6 h；離心并收集菌液，4 ℃，12 000×g離心1 min；棄上清液，將菌體用磷酸緩沖溶液洗滌后煮沸破碎，SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。以空的宿主菌和含表達(dá)載體的宿主菌為對(duì)照，培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件同上。

1.2.4 包涵體含量分析 菌液離心，用磷酸緩沖溶液重懸收集的菌體，菌液保持在冰浴狀態(tài)超聲破碎20 min（超聲5 s，停歇30 s，再超聲5 s），超聲破碎后，12 000 r/min離心3 min，SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析超聲后全液、離心后上清液和沉淀中蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 包涵體的變性與復(fù)性 將pQE 80L-MaPPO533進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，超聲破碎、離心，收集沉淀，得到粗制包涵體。用2 mL變性Ⅰ溶液（50 mmol/L Tris-Cl pH7.5，5 mmol/L DTT，2%Tritonx-100，5 mmol/L NaCl）懸浮，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)此操作一次，然后用2 mL變性Ⅱ[19.2 g尿素溶于40 mL Tris-Cl溶液（50 mmol/L、pH8.0）]溶液懸浮，4 ℃過夜變性。將懸浮液4 ℃ 5 000 r/min離心30 min，保留上清。將上清轉(zhuǎn)入7 500 Da的透析袋中，置于0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.5）溶液中，4 ℃透析12 h，每隔4 h換一次磷酸緩沖溶液。收集透析袋內(nèi)的液體，4 ℃ 、5 000 r/min離心30 min，上清是復(fù)性的蛋白。

1.2.6 包涵體純化 首先如1.2.5得到蛋白變性溶液后，取1 mL裝入10 mL離心管；然后顛倒混勻樹脂，用3 mL無(wú)菌水懸浮樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，并重復(fù)此步驟2次；接著用6 mL的Native binding buffer平衡樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，再加入3 mL Native binding buffer；取1 mL蛋白質(zhì)變性溶液與樹脂4 ℃混合2～3 h，500 r/min離心5 min，棄上清；用4 mL的Native wash buffer懸浮樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次；最后用2 mL的Native Elution buffer（含250 mmol/L咪唑）懸浮樹脂，4 ℃混合1～2 h，500 r/min離心5 min，收集上清。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析 參照Galeazzi等[18]的方法。

1.2.8 重組蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 從 SDS-PAGE 的凝膠上切下重組蛋白條帶，送至南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉PPO轉(zhuǎn)移肽位置的確定

TargetP 1.1 Server在線預(yù)測(cè)蛋白N端導(dǎo)肽形式，結(jié)果顯示導(dǎo)肽為cTP（葉綠體導(dǎo)肽）、mTP（線粒體導(dǎo)肽）、SP（信號(hào)肽）的可能分值分別為0.878、0.118和0.038（表1），說明香蕉PPO全蛋白導(dǎo)肽為cTP（葉綠體導(dǎo)肽）的可能性最大，即香蕉PPO存在于葉綠體的可能性最大。另外，利用ChloroP 1.1 Server軟件對(duì)其葉綠體轉(zhuǎn)移肽進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果見表2，香蕉PPO存在轉(zhuǎn)移肽的可能性為0.549，大于0.5，因此認(rèn)為香蕉PPO含有長(zhǎng)度為47個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)移肽。所以在香蕉PPO全蛋白（登錄號(hào)：KF900300.1）的基礎(chǔ)上，切除了其N端55個(gè)氨基酸，以第56個(gè)氨基酸即蛋氨酸作為香蕉PPO成熟蛋白的起始氨基酸。香蕉PPO成熟蛋白命名為MaPPO533，成熟蛋白對(duì)應(yīng)的基因命名為MaPPO533。

2.2 MaPPO533基因克隆及原核表達(dá)載體的鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的香蕉pQE80L-MaPPO1重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行MaPPO533基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在1 600 bp左右有明顯的粗帶，與預(yù)期片段大小一致，說明成功克隆到MaPPO533基因（圖1-A）。酶切后的MaPPO533與同樣經(jīng)雙酶切的原核表達(dá)載體pQE80L進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建原核表達(dá)載體pQE80L-MaPPO533。對(duì)構(gòu)建的pQE80L-MaPPO533質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，產(chǎn)物電泳結(jié)果呈現(xiàn)出清晰的2條帶（圖1-B），分別為pQE80L（4 800 bp）和MaPPO533（1 599 bp），測(cè)序結(jié)果也證實(shí)連接成功。

2.3 MaPPO533成熟蛋白的原核表達(dá)

對(duì)香蕉pQE80L-MaPPO533 M15進(jìn)行蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示pQE80L-MaPPO533在IPTG誘導(dǎo)后于約62 ku處有一條特異性帶，與其重組質(zhì)粒的目的蛋白理論分子量大小基本一致，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pQE80L空載體則無(wú)該目的條帶，說明香蕉pQE80L-MaPPO533在大腸桿菌中成功表達(dá)，并且隨著IPTG濃度的增大，蛋白表達(dá)量逐漸增大，當(dāng)IPTG濃度為0.6 mmol/L時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值（圖2）。

2.4 pQE80L-MaPPO533表達(dá)產(chǎn)物包涵體含量分析

pQE80L-MaPPO533宿主菌經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎、離心后，分別取全液、上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（圖3），目的蛋白主要在沉淀中，上清中看不到表達(dá)條帶，說明表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，這可能與pQE80L-MaPPO533表達(dá)量小及原核表達(dá)通常存在目的蛋白以包涵體的形式表達(dá)有關(guān)。

2.5 包涵體的變性、復(fù)性及酶活力分析

包涵體為不溶性蛋白，無(wú)酶活力，故對(duì)香蕉pQE80L-MaPPO533包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性，以獲得可溶性的香蕉MaPPO533。本研究中香蕉pQE80L-MaPPO533包涵體經(jīng)系列溶液洗滌、溶解和超濾復(fù)性后，SDS-PAGE電泳顯示得到單一的目的條帶，基本去除雜蛋白，但目的條帶弱（圖 4）。同時(shí)，以鄰苯二酚為底物，檢測(cè)目的蛋白超聲破碎后全液的酶活力為4.07 U/mg，而復(fù)性蛋白的酶活力為23.61 U/mg，酶活力提高了5.8倍。

2.6 蛋白質(zhì)測(cè)序驗(yàn)證

將目的條帶進(jìn)行激光輔助解析/飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）測(cè)序（圖5），并通過Mascot軟件對(duì)質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索鑒定，結(jié)果如圖6所示，最后確定重組表達(dá)蛋白為香蕉PPO。

3 討論與結(jié)論

前人研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移肽幾乎存在于所有植物的PPO中[19-20]。在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移肽具有運(yùn)輸PPO并定位放置PPO的功能，并在完成相關(guān)功能后被切除，從而形成成熟的PPO蛋白[19-20]。但在大腸桿菌中，真核基因的轉(zhuǎn)移肽不能被大腸桿菌識(shí)別，從而不能形成正確的剪切和折疊，而且導(dǎo)肽位于蛋白翻譯起始序列，這部分沒有功能但是非常疏水，因此往往導(dǎo)致PPO全長(zhǎng)基因在大腸桿菌中難以表達(dá)， 劉敬衛(wèi)等的研究結(jié)果也表明N端的導(dǎo)肽序列對(duì)蛋白的正確折疊確有影響，切去導(dǎo)肽后可降低基因?qū)Υ竽c桿菌的毒害作用，有利于蛋白表達(dá)量的增加，并且目前已有對(duì)多酚氧化酶原核表達(dá)的報(bào)道，基本都將PPO基因的導(dǎo)肽切除，然后進(jìn)行原核表達(dá)[21-23]。筆者之前對(duì)香蕉PPO全長(zhǎng)基因誘導(dǎo)表達(dá)，就存在未表達(dá)的情況。但本研究對(duì)香蕉PPO全蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)移肽去除后，成功表達(dá)出了目的蛋白，說明可能也存在N端的導(dǎo)肽序列對(duì)蛋白的正確折疊產(chǎn)生影響，從而影響蛋白表達(dá)的可能。

MaPPO533蛋白表達(dá)時(shí)主要形成包涵體，上清中幾乎沒有可溶性蛋白。包涵體是細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)互相凝集而形成的無(wú)活性固體顆粒，是大腸桿菌異源表達(dá)時(shí)的常見現(xiàn)象[24]。包涵體蛋白雖然往往無(wú)生物活性，需要重新溶解和復(fù)性，但包涵體的形成有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性，同時(shí)包涵體中雜蛋白的含量少，這也為重組蛋白的分離與純化帶來了極大的方便，通過對(duì)包涵體的純化，可得到純度較高的目的蛋白[25-26]。為此，筆者們采取了對(duì)包涵體的變性復(fù)性研究，雖然電泳顯示目的條帶較弱，但酶活性測(cè)定結(jié)果表明，復(fù)性后酶活力是復(fù)性前的5.8倍。為了得到大量高活性的香蕉PPO重組蛋白，在今后的研究中可嘗試將香蕉PPO進(jìn)行真核表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過生物工具在線分析對(duì)克隆得到的香蕉PPO全蛋白進(jìn)行了轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析，然后去除并成功實(shí)現(xiàn)了香蕉成熟PPO蛋白的原核表達(dá)，并通過質(zhì)譜鑒定，結(jié)果確定重組表達(dá)蛋白為香蕉PPO。這將對(duì)從基因水平和蛋白水平研究香蕉多酚氧化酶在香蕉褐變生理和調(diào)控機(jī)制中的作用有一定的指導(dǎo)作用。

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