牛姍姍

摘要通過分析重金屬復合污染下歐洲地中海沿岸原產(chǎn)植物迷迭香體內(nèi)非蛋白巰基化合物（植物螯合肽、谷胱甘肽、半胱氨酸等）和5種重金屬含量的變化，初步探討迷迭香中生物標志物的金屬脅迫。結(jié)果表明，重金屬污染下迷迭香中非蛋白巰基含量最高為葉部，莖、根部含量低于葉部15～50倍。污染區(qū)葉部巰基含量明顯高于對照區(qū)（P<0.05）； 植物體內(nèi)重金屬鉛、鋅含量較高，其次為砷和鎘，銅只在部分根部有檢出。特定重金屬與植物非蛋白巰基化合物之間存在正比關(guān)系，迷迭香對重金屬具有積累能力和抗性。

關(guān)鍵詞非蛋白巰基；植物螯合肽；重金屬；迷迭香

中圖分類號S181.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-234-02

Study on the Accumulation of Heavy Metals and Pollution Stress of Rosmarinus officinalis in an Abandoned Mine

NIU Shanshan （Shaanxi Environmental Monitoring Technical Services Advisory Center， Xian， Shaanxi 710054）

Abstract

Through analyzing content changes of nonprotein thiols compounds in Rosmarinus officinalis，the metal stress of biomarkers of study plant was discussed.Results showed that the maximum amount of thiols was detected in leaves of experimental plants， in stems and roots， the concentration was 15 to 50 times below than the concentration in leaves.The nonprotein thiols compounds in experimental area plants were significantly higher than the control area （P<0.05）. Heavy metal test results show that the concentrations of lead and zinc in plants have higher levels， followed by arsenic and cadmium， copper only is detected in the roots of two plants in the control area. The results showed that there is a positive relationship between the specific heavy metals and the nonprotein thiols compounds. The plant Rosmarinus officinalis has the accumulation capacity and resistance for heavy metals.

Key wordsThiols； PCs； Heavy metal； Rosmarinus officinalis

植物體內(nèi)的重金屬解毒主要有非蛋白巰基參與，植物中非蛋白巰基化合物在植物對金屬的吸收、轉(zhuǎn)運、積累及耐受性等方面都起到重要的作用，其中植物螯合肽（Phytochelatins， PCs，又稱植物絡合素）是研究熱點之一。PCs是重金屬脅迫誘導下植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)與金屬硫蛋白（metallothionein， MT）相似的，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成的富含巰基的螯合多肽，結(jié)構(gòu)多為（γGluCys）nGly（n=2～11），由谷胱甘肽（GSH）經(jīng)植物絡合素酶（phytochelatin synthase， PCS）催化合成。由于其巰基含量高，對重金屬的親和力大，能夠螯合多種重金屬離子，使重金屬離子失去活性。多種金屬可誘導植物體內(nèi)PCs的產(chǎn)生，其中鎘（Cd）是最強的誘導因子[1-2]。自1985年Grill等[3] 首次在Cd脅迫蛇根木（Rauvolfia serpentina）的植物細胞中分離得到PCs以來，由于其在去除植物重金屬毒性中的作用及作為重金屬污染物暴露早期預警指標的雙重作用而受到國內(nèi)外學者的高度重視。而谷胱甘肽（glutathione，GSH） 由于其與PCs之間特殊的關(guān)系，也成為研究熱點之一。谷胱甘肽屬于含有巰基的小分子肽類物質(zhì)，具有重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽上的巰基易與碘乙酸、芥子氣（一種毒氣）、鉛、汞、砷等重金屬鹽絡合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽有還原型和氧化型兩種形式，在生理條件下以還原型谷胱甘肽為主。研究表明，植物螯合肽在非蛋白巰基中占絕大部分。還原型谷胱甘肽GSH和氧化型谷胱甘肽GSSG也在非蛋白巰基中占有一定比例，同時也有其他的非蛋白巰基，如半胱氨酸Cys等，但在非蛋白巰基中所占比例非常小。

通過檢測

重金屬污染下

植物中非蛋白巰基化合物的含量，更好地理解試驗植物金屬脅迫的生理及分子機制。筆者選用地中海地區(qū)多年生木本植物迷迭香（Rosmarinus officinalis）作為試驗植物，研究礦業(yè)廢棄地迷迭香植物對重金屬的積累機理，探討其對重金屬污染的抗性能力。

1材料與方法

1.1試驗材料

污染源為法國南部城市馬賽東南沿海的一座建于19世紀的鉛鋅選礦廠，該廠于20世紀20年代棄用，至今仍有約6萬t有鉛、鋅殘留的礦渣堆放在礦場原址內(nèi)。試驗植物分別選自污染和未污染（對照） 2個區(qū)域，其中污染區(qū)域（A）位于一礦渣堆放地，對照（B）位于礦場原址附近的山坡。試驗植物為來自地中海地區(qū)的野生、矮小、芳香多年生木本植物迷迭香（Rosmarinus officinalis），從A、B區(qū)域分別取莖直徑2.5～3.5 cm、葉冠直徑50～70 cm的3株試驗植物，每個植株盡量收集所有部分（根、莖、葉、花）。野外采集的試驗材料在實驗室進行預處理，清洗，烘干，莖葉分離，并研磨成粉。

1.2試驗儀器

分光光度計（紫外/可見光）：Hitachi日立 U2800；微波爐：CEM MDS 2000；ICPAES：Jobin Yvon Horiba JY2000。

1.3試驗方法

1.3.1巰基提取和分析。往1 g樣品中加入10 ml 0.02 mol/L的EDTA，反應30～60 min后，將樣品放入離心機，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min后，取上清液過濾備用[4]。分析試劑選擇DTNB（5，5二硫（2硝基苯甲酸），淺黃色晶體粉末，易溶于水），DTNB一般用于比色法測定生物樣品中的非蛋白巰基。在非蛋白巰基化合物存在的條件下，淺黃色的DTNB將被轉(zhuǎn)變成黃色的5巰基2硝基苯甲酸，在412 nm處具有最大吸收光譜，而殘余DTNB的吸收光譜并不干擾巰基的測定[5]。檢測時，取樣品濾液0.5 ml，加入100 μl 0.01 mol/L DTNB，1.5 ml 0.2 mol/L Tris緩沖液（pH=8.2），及甲醇、水各3.95 ml，反應液共配制10 ml，加入DTNB 5 min后進行檢測[4]。

1.3.2植物重金屬檢測。

稱取0.5 g研磨成粉的干燥植株樣品于微波消解罐中，加2 ml水潤濕，再加入4 ml 65% HNO3和2 ml 30%H2O2。將消解罐放入微波爐轉(zhuǎn)盤內(nèi)，采用三段逐級升溫方式消解，即先加溫至110 ℃保持消解5 min，再升至150 ℃保持消解10 min，最后升溫至160 ℃保持消解5 min，消解結(jié)束。冷卻1 h后，將樣品溶液轉(zhuǎn)入50 ml容量瓶中，用水定容后搖勻，待測。同時做兩份試劑空白。在ICPAES選定的儀器分析條件下，測定樣品中鉛（Pb）、鋅（Zn）、銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）含量。

1.4數(shù)據(jù)處理利用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用配對T檢驗進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1迷迭香中非蛋白巰基含量

由表1可知，迷迭香中非蛋白巰基含量最高為葉部，在莖、根的含量低于葉部15～50倍，表明植物非蛋白巰基化合物對重金屬污染的耐受性在葉片部位表現(xiàn)較為明顯。在植株葉部，A區(qū)的巰基含量顯著高于B區(qū)（P<0.5）。在植株莖部，A、B兩區(qū)非蛋白巰基含量差異不顯著（P>0.05）。植株根部，A區(qū)非蛋白巰基化合物含量低于B區(qū)，但差異不顯著（P>0.05）。

2.2迷迭香中重金屬含量由表2可知，A、B兩區(qū)迷迭香體內(nèi)重金屬鉛、鋅含量較高，其次為砷和鎘，銅只在對照區(qū)部分植株的根部有檢出。鎘在葉中的含量稍大于根、莖部，其他4種重金屬除了鋅對照組略高于根莖外，其余均低于根部，表明特定重金屬與植物非蛋白巰基化合物之間確實存在正比關(guān)系。該試驗較適用于鋅與鎘，它們在葉片中的含量較高。

3討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明，重金屬污染下迷迭香中非蛋白巰基含量最高為葉部，為273.80 μmol/L，莖、根部含量低于葉部15～50倍。在檢測植物體內(nèi)5種重金屬（鉛、鋅、銅、砷、鎘）含量時，發(fā)現(xiàn)葉中僅鎘的含量大于根、莖部，其他4種重金屬除了鋅對照組略高于根莖外，其余均低于根部，說明鎘（Cd）是植物在重金屬污染下應激反應的較強誘導因子[1-2]。鎘在非蛋白巰基檢測中起重要作用，表明PCs能夠從植物根部運輸至地上部，PCs在增加植物鎘從根部向地上部的長距離運輸中發(fā)揮重要作用[6]。

A區(qū)有一植株根部Pb含量為1 147.05 mg/kg，超過目前公認的重金屬超量積累植物的臨界標準（1 000 mg/kg）[7]。重金屬積累植物能吸收并積累大量重金屬于植物地上部，通過細胞壁固定、有機復合物結(jié)合及液泡的分隔作用，使重金屬的毒性下降[8]，而多數(shù)重金屬耐性植物具有外排的機制，能夠把重金屬限制在根部，減少向地上部運輸。而少數(shù)植物則形成了與外排機制相反的積累機制，能夠積累大量重金屬于其地上部，并且還能正常的生長和繁殖。植物對重金屬的超量積累是很罕見的現(xiàn)象，自然界中只有很少植物種類能積累異常高的重金屬于其地上部。鉛（Pb）和鋅（Zn）的根部含量均高于葉部，可能是與重金屬耐性植物的外排作用有關(guān)。 根細胞對大部分必需金屬元素的吸收以主動吸收方式進行，即通過細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白進行轉(zhuǎn)運，部分有毒重金屬的吸收也是依靠這一途徑[9]。鐵（Fe）、銅（Cu）、錳（Mn）、鋅（Zn）是植物正常生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，而鎘（Cd）、鉛（Pb）、砷（As）和汞（Hg）是對植物有很大毒性的非必需元素，這些元素過量時都會對植物產(chǎn)生毒害。植物根系有著巨大的表面積，在生長發(fā)育過程中，會從土壤中吸收一定量的有益元素，同時也會吸收有毒的重金屬，并將它們分配到不同的細胞、細胞器進行區(qū)域化分隔，以維持細胞正常的生理功能。在吸收和轉(zhuǎn)運的整個過程中，膜轉(zhuǎn)運蛋白起著至關(guān)重要的作用。近10年來，隨著重金屬離子在酵母中轉(zhuǎn)運機制的進一步研究，植物對重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運也取得了很大進展，植物中許多與重金屬吸收、轉(zhuǎn)運有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白基因家族被鑒定。除了鉬（Mo）以外，所有必需元素都至少有一個公認的轉(zhuǎn)運蛋白被鑒定，如鋅（Zn）轉(zhuǎn)運蛋白（ZIP）是負責Zn2+和Fe2+轉(zhuǎn)運的膜蛋白，在Zn超量積累植物天藍遏藍菜（T.caerulescens）的根中ZIP的含量比非超量積累植物T.arvese要高[10]，說明超量積累植物比普通植物有更為復雜的離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

試驗結(jié)果表明，迷迭香具有重金屬積累能力，對重金屬污染具有抗性。植物體內(nèi)重金屬與植物非蛋白巰基化合物之間確實存在正比關(guān)系。因此，可用非蛋白巰基化合物及植物螯合肽的含量指示重金屬對植物的毒害程度，可作為一種金屬污染標志物，在植物重金屬復合污染的預警、評價處理中起到重要作用。植物螯合肽和非蛋白巰基化合物都是植物中重金屬污染的生物指示劑，它們在金屬的吸收、轉(zhuǎn)運、積累及耐受性等方面都起到作用，同時也對植物體內(nèi)的重金屬起解毒作用。另外，有學者對非蛋白巰基化合物及PCs 的解毒作用曾提出過質(zhì)疑。有研究表明，耐性植物體內(nèi)的CdPCs反而比非耐性作物低[11]，可能是由于Cd與功能蛋白相結(jié)合，使耐性降低。 重金屬PCs的形成雖是一些植物耐重金屬的重要機制，但其能力是有限的，植物中可能還存在其他尚未發(fā)現(xiàn)的解毒機制，因此仍應繼續(xù)加強相關(guān)領(lǐng)域的研究。

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