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        高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星

        2015-04-29 22:11:03王洋李媛媛王寒冰李瀅倩王瀟
        吉林蔬菜 2015年2期
        關(guān)鍵詞:諾氟沙星環(huán)丙沙星沙星

        王洋 李媛媛 王寒冰 李瀅倩 王瀟

        摘 要:建立飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定方法。試樣用磷酸鹽緩沖溶液提取,經(jīng)固相萃取小柱凈化,氮?dú)獯蹈珊笥萌芙獯郎y(cè)。采用LC-MS/MS測(cè)定,色譜柱為C8反相色譜柱,流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液,電噴霧正離子模式電離,多反應(yīng)選擇離子檢測(cè)(MRM),外標(biāo)法定量。結(jié)果表明方法可用于飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的同時(shí)測(cè)定。。

        關(guān)鍵詞:飼料;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;恩諾沙星;環(huán)丙沙星;諾氟沙星;多反應(yīng)監(jiān)測(cè) 【中圖分類號(hào)】TS214.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

        恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星屬于喹諾酮類藥物,由于其具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌濃度低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物感染性疾病的預(yù)防和治療。但有一部分生產(chǎn)者將其應(yīng)用到飼料產(chǎn)品中,起到抑菌殺菌的作用。如果動(dòng)物食用這種飼料會(huì)造成一定的危害,產(chǎn)生耐藥性或一些毒副作用。因此,建立快速準(zhǔn)確地測(cè)定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法,對(duì)于加強(qiáng)飼料產(chǎn)品監(jiān)管具有重要意義。

        本文建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)快速準(zhǔn)確地測(cè)定飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的方法,可滿足檢測(cè)要求,為飼料產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)提供技術(shù)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與材料

        Agilent 1200LC/-6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司);BS224S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);HYQ-2110液體混勻器(蘇州捷美電子有限公司);KQ-250DE超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);Microfuge離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)。

        恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品,純度>98%(美國(guó)SIGMA公司);乙腈、甲酸為色譜純(Burdick&Jackson公司);無(wú)水乙醇(分析純,天津市化學(xué)試劑有限公司);樣品購(gòu)自本地超市。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        分別精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星0.005g于50mL容量瓶中,然后用甲醇溶解并稀釋至刻度,于冰箱4℃以下避光保存。用流動(dòng)相液將恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星儲(chǔ)備液液稀釋成10μg/mL的工作液。

        1.2.2 樣品處理

        稱取試樣0.5g(精確至0.1mg)于50mL具塞離心管中,準(zhǔn)確加入6mL磷酸鹽緩沖溶液,渦旋混勻,再加入10mL乙腈,于渦旋振蕩器振蕩提取1min,5000r/min離心5min,上清液過濾到雞心瓶中,在殘?jiān)屑尤?mL磷酸鹽緩沖溶液,10mL乙腈,重復(fù)以上步驟,合并上清液,于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸鹽緩沖溶液,混勻。

        固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸鹽緩沖溶液活化,保持柱體濕潤(rùn)。將樣液以1mL/min的流速全部過HLB固相萃取小柱,待液體完全流出后,先后以4mL水,4mL甲醇水溶液淋洗,抽干,用4mL氨水甲醇溶液洗脫于10mL具刻度離心管中,洗脫液于50℃,氮吹至約0.2mL時(shí)停止?jié)饪s,用甲醇-甲酸溶液定容至1mL,5000r/min離心5min,過0.2μm濾膜,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

        1.2.4 儀器參數(shù)和測(cè)定條件

        液相色譜條件:C8反相色譜柱(C82.1mm×50mm id,5μm);柱溫:30℃;流速:0.5mL/min;進(jìn)樣量:5μL;流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸水溶液(15+85)。

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);噴霧壓力:35psi;干燥氣流速:8mL/min;離子化溫度:340℃。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品提取方法的選擇

        喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有羧基和哌嗪基,屬于酸堿兩性化合物,在酸性和堿性溶液中有較好的溶解性。因此嘗試用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取,此時(shí)待測(cè)物以負(fù)離子形式存在,過固相萃取小柱后就富集在了小柱上,然后再用酸化甲醇進(jìn)行洗脫[1-4]。

        2.2 色譜條件的優(yōu)化

        在一定的流動(dòng)相條件下,喹諾酮類藥物在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留,選擇實(shí)驗(yàn)室常用的C8柱(50mm×2.1mm)。應(yīng)用反相色譜條件時(shí),LC-MS/MS分析方法應(yīng)用的有機(jī)相主要為甲醇和乙腈,喹諾酮類藥物在甲醇中的信號(hào)要比在乙腈中高,選用乙腈作為有機(jī)相時(shí),待分析組分的色譜行為較好。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會(huì)抑制其信號(hào),甲酸體積分?jǐn)?shù)越高抑制信號(hào)越嚴(yán)重,但考慮到能夠改善峰形,使待測(cè)物與內(nèi)源性物質(zhì)充分分離,所以選擇了0.1%的甲酸作為水相(見圖1)。

        2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,盡可能的使待測(cè)物響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最高。在優(yōu)化過程中比較恩諾沙星在正、負(fù)兩種離子化方式的響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)正離子化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于負(fù)離子,正離子響應(yīng)值高,因此選擇了正離子掃描方式。采用Product掃描的方式選擇特征離子,逐步加大誘導(dǎo)碰撞能量,隨著母離子的豐度逐漸減少,子離子的豐度逐漸增加,分別選用豐度最大的兩個(gè)子離子作為定量和輔助定性離子,并確定其最佳碰撞能量值,在Product方式中進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量,以便獲得最大靈敏度(見表1,圖2-4)。

        2.4 線性與檢出限

        取陰性樣品,依次加入適量待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)定條件下分別進(jìn)樣,以標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo),工作溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量,恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星檢出限為10μg/kg。

        2.5 方法的回收率和精密度

        根據(jù)GB/T 5009.1-2003,我們選取1種空白飼料樣品,分別加入50μg/kg水平的三種喹諾酮藥物,按照樣品處理方法及相同的色譜條件下,進(jìn)行回收率的測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)3次,計(jì)算出每個(gè)添加水平的回收率(結(jié)果見表2)。

        3 結(jié)論

        本文建立了飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法,該法具有樣品處理簡(jiǎn)單、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn),適用于大量樣品的快速篩選、測(cè)定。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 謝東華,俞雪鈞,殷居易,倪梅林.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)烤鰻中環(huán)丙沙星[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2008(44)5:402-408.

        [2] 張翠英,徐金玲,王雪芹,安華民.超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)鹽酸洛哌丁胺膠囊中混入諾氟沙星的研究[J].中國(guó)藥房,2008(19)7:537-539.

        [3] 崔相勇,張鳳清,周長(zhǎng)民,王巖松,鐘啟智.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定豆芽中恩諾沙星含量[J].食品科學(xué),2012(33)20:180-183.

        [4] 李小玲,黃向榮,萬(wàn)譯文,陳湘藝.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2013(3)4:25-30.

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