牛耀祖 白麗娟 許立華

摘要以病原微生物實驗室檢測為基礎(chǔ)，與臨床、病理相結(jié)合，將采集到乳樣、糞樣等樣品利用選擇及鑒別培養(yǎng)基對病原微生物進(jìn)行分離與培養(yǎng)，結(jié)合革蘭氏染色鏡檢、生化試驗，并最終通過血清學(xué)鑒定的方法分離到寧夏地區(qū)奶牛致病性大腸桿菌的5個優(yōu)勢血清型。通過藥敏試驗，將結(jié)果及時反饋到牧場，為牧場的安全生產(chǎn)起到了積極的作用。

關(guān)鍵詞奶牛；疾病；大腸桿菌；血清型；乳房炎

中圖分類號S858.23文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）28-128-02

大腸埃希菌，俗稱大腸桿菌，大多數(shù)為人和溫血動物腸道內(nèi)的正常菌群，人和動物出生后很快便可經(jīng)口進(jìn)入消化道內(nèi)，大量繁殖而定居，終身伴隨，并經(jīng)糞便不斷散播于周圍環(huán)境[1]。因此，大腸桿菌在環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生學(xué)上作為食品被糞便污染的直接或間接指標(biāo)。大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢的直桿菌，大小為（0.4～0.7）μm×（2～3）μm，兩端鈍圓，散在或成對，大多數(shù)菌株以周身鞭毛運動，但也有無鞭毛的變異株。大多數(shù)對人和動物致病的菌株還常有與毒力相關(guān)的特殊菌毛。某些菌株有莢膜或微莢膜。堿性染料對本菌有良好著色性，菌體兩端偶爾略深染。大腸埃氏菌為兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基上生長良好，最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH為7.2～7.4，麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌落；在SS瓊脂上一般不生長或生長較差，生長者呈紅色。一些致病性菌株在綿羊血平板上呈β溶血。在營養(yǎng)瓊脂上生長24 h后，形成圓凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落[2]。此菌能發(fā)酵多種碳水化合物并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大多數(shù)菌株可迅速發(fā)酵乳糖和山梨醇，極少數(shù)遲發(fā)酵或不發(fā)酵，約半數(shù)菌株不分解蔗糖，幾乎不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素。吲哚和甲基紅試驗結(jié)果均為陽性，VP試驗和枸櫞酸鹽利用試驗結(jié)果均為陰性。大腸桿菌主要有O、K、H 3種抗原，均為菌體表面抗原，是該菌血清型鑒定的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。其中，O抗原有173種，K抗原有80種，H抗原有56種。

筆者以奶牛乳房炎及導(dǎo)致犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌（Escherichia coli）為研究對象，對寧夏區(qū)內(nèi)各主要奶牛養(yǎng)殖區(qū)E.coli的病原學(xué)和流行病學(xué)開展研究，并在此基礎(chǔ)上對分離的大腸桿菌針對O抗原進(jìn)行血清型的分型與鑒定，分析寧夏主要奶牛養(yǎng)殖區(qū)E.coli優(yōu)勢血清型的流行與分布情況，以期為寧夏回族自治區(qū)防控大腸桿菌病提供重要的病原學(xué)及流行病學(xué)資料。

1材料與方法

1.1樣本采集

主要針對腹瀉犢牛和乳房炎成母牛進(jìn)行樣品采集，現(xiàn)場采集犢牛排泄物，必要時采集血液。采集乳房炎牛乳樣和糞樣，嚴(yán)重病例視情況采集血液、淋巴液、鼻腔拭子、關(guān)節(jié)液，部分病死牛剖解后只采集心肌、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟、胃腸及某些淋巴結(jié)（如腸系膜淋巴結(jié)、腎門淋巴結(jié)）。

1.2方法

1.2.1樣品處理。根據(jù)臨床癥狀及牧場獸醫(yī)的講述并作記錄，采集到具有診斷意義的樣品，將采集的樣品（包括組織樣、血樣、乳樣、糞樣及鼻腔拭子等）有針對性地分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂，麥康凱顯色培養(yǎng)基和伊紅美蘭顯色培養(yǎng)基上有必要時再接種血瓊脂平板，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中在37 ℃和一定濕度條件下經(jīng)過18～24 h培養(yǎng)后，根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色、表面性狀、透明度、和溶血性等對細(xì)菌作初步識別，然后挑取單一菌落通過革蘭氏染色后鏡檢觀察，同時挑取單個可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，直到獲得單一菌株，以此進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，收獲保存。將單一疑似菌落接種至500 μl營養(yǎng)肉湯中置于滅菌的2 ml規(guī)格的凍存管中，放在水浴搖床上過夜培養(yǎng)后取出，在超凈臺中用60%的甘油與含有菌株的營養(yǎng)肉湯按2∶1的比例封存于2 ml的凍存管中，置于4 ℃冰柜中3～4 d后移入-20 ℃的環(huán)境中，以備后期進(jìn)行生化鑒定、藥敏試驗并最終作出分型鑒定。

1.2.2革蘭氏染色。

將純培養(yǎng)后待凍存的菌液用革蘭氏染色并法進(jìn)行染色并鏡檢。 革蘭氏染色法包括結(jié)晶紫初染1 min、革蘭氏碘液媒染1～2 min、95%的酒精脫色30～40 s沙黃復(fù)染40～60 min，其中結(jié)晶紫配制時用蒸餾水配制。

1.2.3細(xì)菌生化試驗。

細(xì)菌微量生化試驗管，購自杭州天和微生物試劑有限公司，所采用的微量管有硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、靛基質(zhì)、MR、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖，外加氧化酶。首先挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上黑色金屬樣光澤的菌落于營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行氧化酶試驗，陰性者再進(jìn)行進(jìn)一步生化鑒定，然后將氧化酶陰性者分別接種到各微量管中，根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管結(jié)果判定表，對應(yīng)地將反應(yīng)結(jié)果記錄在腸桿菌科GYZ-15e編碼鑒定結(jié)果記錄表中，然后對照腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊（第2代15e系統(tǒng)），依據(jù)編碼做出判定。

1.2.4藥敏試驗。

將凍存的菌液取出復(fù)壯后進(jìn)行體外抑菌試驗[4]，采用藥敏片法，所選藥敏片也是根據(jù)牛場用藥情況，部分為新選藥物，以便指導(dǎo)臨床用藥，另一部分則為確認(rèn)實驗室工作與牛場實際工作中用藥情況的一致性，因此選取的藥敏片種類較多。所用藥敏片的種類包括：β內(nèi)酰胺類藥物有頭孢拉唑、頭孢噻肟等；氨基糖苷類藥物有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、新霉素等；四環(huán)素類藥物有四環(huán)素、多西環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類藥物泰樂菌素等。試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSD）制定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.5O抗原分型鑒定。利用血清凝集試驗進(jìn)行大腸桿菌O抗原血清型分型鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

在麥康凱培養(yǎng)基上菌落生長茂盛，呈紅色菌落，圓形，邊緣齊整，隆起較高，表面光滑，比較濕潤，中等大小。伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上菌落長勢茂盛，呈黑色金屬光澤，圓形，邊緣齊整，隆起不高，表面光滑，中等大小。在血瓊脂培養(yǎng)基上長出呈圓形、邊緣齊整，表面光滑的單個菌落，并出現(xiàn)清晰的β溶血。

2.2革蘭氏染色鏡檢

經(jīng)過革蘭氏染色后，在100倍油鏡下可見視野中存在大量呈革蘭氏陰性染色，兩端鈍圓的小桿菌，散在分布，偶爾可見革蘭氏陰性中等大小的桿菌，無雜菌。

2.3藥敏試驗結(jié)果由于所涉及的大腸桿菌菌株較多，通過藥敏結(jié)果2株大腸桿菌的抑菌圈直徑見表1。

2.4生化試驗結(jié)果

純化的大腸桿菌菌株較多，10株大腸桿菌的生長試驗結(jié)果見表2。通過對照腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊（第2代15e系統(tǒng)）后，所檢測的10株菌株均為大腸桿菌，因此進(jìn)一步確認(rèn)了所用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的可靠性。

3討論

從前期處理并保存的229株大腸桿菌中，解凍復(fù)壯后經(jīng)麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基再次接種培養(yǎng)后、用革蘭氏染色鏡檢將形態(tài)符合的菌株進(jìn)行生化試驗確定為大腸桿菌后，最終用30種O抗原血清型進(jìn)行分型鑒定，結(jié)果表明共有78株分離菌株鑒定出血清型，另有4株發(fā)生自凝現(xiàn)象。同時，O10、O53、O92、O101、O158這5種血清型占參與分型樣品的61.2%，其他血清型共占38.8%。因此，在銀川地區(qū)奶牛O抗原血清型中以上5種為優(yōu)勢血清型，結(jié)合臨床病例其影響不容忽視。

根據(jù)陸承平主編的《獸醫(yī)微生物學(xué)》第4版中，目前大腸桿菌O抗原有170種，K抗原有80種，H抗原有56種。此次試驗僅針對O抗原進(jìn)行檢測，除了以上5種優(yōu)勢血清型外，其他血清型雖然所占比例較小，但所占比例小不代表致病性弱，其危害性依然不可小視。從藥敏試驗結(jié)果來看，慶大霉素及頭孢噻肟的作用效果較為明顯，但是不同血清型的大腸桿菌其致病性和致病力不同[5]。以某些患牛在采樣前已經(jīng)

不同程度用藥。這里僅作為參照說明大腸桿菌病在寧夏回族自治區(qū)的相關(guān)情況。建議牛場選用后，從部分牛只的治療效果來看，通過藥敏試驗針對性地選擇藥物對疾病的治療起到了積極的效果。后來有一些牧場發(fā)現(xiàn)連續(xù)用藥3～5 d效果不再明顯，經(jīng)詢問病牛之前也使用過這些藥物或者同類藥物，再次印證了在牧場實際生產(chǎn)工作中抗生素的使用容易引起耐藥性的。大腸桿菌對多種藥物敏感，但其敏感性易變，因此應(yīng)注意合理用藥。聯(lián)合用藥及輪換用藥，為了準(zhǔn)確選用敏感藥物，定期對此牧場的大腸桿菌菌株進(jìn)行藥敏試驗是有益的。因此，牧場不僅要對國家強(qiáng)制要求的重大疫病進(jìn)行嚴(yán)格免疫，對于自場滅活苗、自場臟器苗等這些能有效預(yù)防奶牛乳房炎的措施也應(yīng)當(dāng)高度重視。密切關(guān)注奶牛健康情況，對一些發(fā)病的奶牛做到積極護(hù)理、妥善治療。進(jìn)一步加強(qiáng)并規(guī)范奶牛日常飼養(yǎng)管理工作[6]，使奶牛乳房炎頻發(fā)、反復(fù)發(fā)作、隱性乳房炎激增、病死牛的突發(fā)、甚至重大傳染病等問題得到有效控制。

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