曲曉軍 王金英 夏海華等

摘要

[目的]評(píng)價(jià)重組乳酸乳球菌的異常毒性，為其制備黏膜免疫活載體疫苗及免疫型微生態(tài)制劑提供理論支持。[方法]給小白鼠腹腔注射不同劑量的表達(dá)金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36cclfA菌液，評(píng)價(jià)重組乳酸乳球菌的異常毒性。[結(jié)果]注射高、中、低劑量重組乳酸乳球菌液的各組小白鼠7d內(nèi)無(wú)一死亡，體重增長(zhǎng)正常。[結(jié)論]重組乳酸乳球菌對(duì)機(jī)體未見(jiàn)異常毒性，適合制備黏膜免疫基因工程活載體疫苗和免疫型微生態(tài)制劑。

關(guān)鍵詞重組乳酸乳球菌；異常毒性；腹腔注射

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）28-022-02

Abstract[Objective]TheaimwastoevaluateabnormaltoxicityofrecombinantLactococcuslactis.，andprovidetheoreticalsupportforitsapplicationinthemucosalimmunevaccineandimmunemicroecologicalpreparation.[Method]ThemicewereintraperitoneallyinjectedwithdifferentdosesofrecombinantLactococcuslactisMG1363/pMG36cclfAstrainwithexpressingfibrinogenlectinAofStaphylococcusaureustoevaluateitsabnormaltoxicity.[Result]Theresultsshowedthat，injectionofhigh，mediumandlowdoserecombinantLactococcuslactisfluidofmicewithin7d，increasedweightwasnormalwithoutadeath.[Conclusion]RecombinantLactococcuslactishadnoabnormaltoxicitytotheorganismanditwassuitableforthepreparationofmucosalimmunegeneengineeringlivevectorvaccineandimmunemicroecologicalpreparation.

KeywordsRecombinantLactococcuslactis；Abnormaltoxicity；Intraperitonealinjection

乳酸菌是一大類(lèi)可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其對(duì)人體和動(dòng)物無(wú)致病性，被公認(rèn)為是安全級(jí)別的有益微生物 [1]。研究表明，乳酸菌具有提升機(jī)體免疫能力、抑制腫瘤、抑制腸道中致病菌生長(zhǎng)、預(yù)防和治療各類(lèi)腹瀉以及合成維生素等功效 [2-7]。

乳酸菌包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等二十幾個(gè)屬 [8]。乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）屬于乳酸菌的典型菌種，是其模式菌 [9]，為兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌，是乳品發(fā)酵工業(yè)的重要菌株，在醫(yī)藥工程及食品領(lǐng)域具有非常重要的應(yīng)用前景 [10]。乳酸乳球菌可耐受胃腸道低pH、蛋白酶及高膽鹽等惡劣條件，在人體內(nèi)存活2～3d，其不攻擊腸道黏膜，不會(huì)引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng) [11]。近年來(lái)，隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，乳酸乳球菌分子生物學(xué)及作用機(jī)制方面的研究也取得了重要進(jìn)展，乳酸乳球菌完整基因組已經(jīng)完成了測(cè)序工作 [8]，這為乳酸乳球菌基因工程技術(shù)的發(fā)展和表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建奠定了重要基礎(chǔ)。因此，一系列基因表達(dá)載體和受體系統(tǒng)也相繼建立起來(lái) [12]，以乳酸乳球菌為載體表達(dá)外源蛋白已成為生物制藥和疫苗研究的熱點(diǎn) [13]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一類(lèi)重要的條件致病菌，能引起人體表皮感染、化膿性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等 [14-15]，美國(guó)每年因被金黃色葡萄球菌感染而喪生的人數(shù)已超過(guò)死于艾滋病人數(shù) [16]。同時(shí)，金黃色葡萄球菌也是國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的細(xì)菌性食物中毒病原之一，由其引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的33% [17-18]。在畜禽感染方面，金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳房炎、豬羊皮炎和流產(chǎn)、羔羊敗血病、馬創(chuàng)傷性感染、膿腫、蜂窩織炎、雞的壞疽性皮炎、敗血病等疾病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失 [19]。

金黃色葡萄球菌對(duì)機(jī)體的感染首先需要黏附到宿主組織表面，然后釋放出各種毒素及酶，對(duì)機(jī)體造成傷害。而實(shí)現(xiàn)黏附目的的組分位于金黃色葡萄球菌表面，稱(chēng)之為黏附素（adhesin）。黏附素是一類(lèi)蛋白質(zhì)，包括纖黏蛋白原凝集素A、B（FibrinogenbindingproteinsclumpingfactorAandB，ClfA，CIfB）、纖黏蛋白A、B（fibronectinbindingproteinsAandB，F(xiàn)nBPA，F(xiàn)nBPB）、膠原結(jié)合蛋白（collagenbindingprotein，Can）和A蛋白（proteinA）等 [20]。ClfA是金黃色葡萄球菌重要的黏附素之一，編碼ClfA的基因clfA，在迄今為止所有臨床分離的金黃色葡萄球菌中都存在，因此，以黏附素ClfA為靶位進(jìn)行疫苗研制是預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染的有效選擇 [19]。

筆者以評(píng)價(jià)前期構(gòu)建的表達(dá)金黃色葡萄球菌黏附素ClfA的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株的異常毒性為目的，為下一步制備基因工程黏膜免疫活載體疫苗、新型免疫型微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。ICR系清潔級(jí)小白鼠，雌性，18～22g，購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共計(jì)40只，分為4組，每組10只。

1.1.2菌株。重組乳酸乳球菌（MG1363/pMG36cclfA）由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所應(yīng)用醫(yī)學(xué)微生物研究室構(gòu)建。

1.1.3培養(yǎng)基。MRS肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4主要儀器設(shè)備。獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具，超凈工作臺(tái)，細(xì)菌麥?zhǔn)媳葷醿x，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2方法

1.2.1重組乳酸乳球菌增菌培養(yǎng)。將重組乳酸乳球菌（MG1363/pMG36cclfA）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，30℃靜止培養(yǎng)28h。

1.2.2重組乳酸乳球菌標(biāo)準(zhǔn)濃度菌液制備。將重組乳酸乳球菌培養(yǎng)物4℃、4000r/min離心20min，收集沉淀，用100ml0.9%氯化鈉注射液洗滌3次，沉淀溶于50ml0.9%氯化鈉注射液中，用細(xì)菌麥?zhǔn)媳葷醿x精確校正菌液濃度4.0×10 4、2.0×10 7、1.0×10 8CFU/ml（以0.9%氯化鈉注射液為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液）。

1.2.3異常毒性試驗(yàn)。隨機(jī)將40只小鼠分為4組，即對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只，每只小鼠試驗(yàn)前編號(hào)、標(biāo)記、稱(chēng)重。高劑量組給1.0×10 8CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，中劑量組給2.0×10 7CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，低劑量組給4.0×10 4CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，對(duì)照組給0.9%氯化鈉注射液0.5ml，全部試驗(yàn)組均一次性腹腔注射給藥，觀察給藥后0～7d小鼠的存活及健康情況，7d后試驗(yàn)結(jié)束，每只小鼠稱(chēng)重，記錄結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

小鼠腹腔注射給藥后，對(duì)照組及高、中、低劑量組小鼠全部健存，皮膚、毛色和活動(dòng)均無(wú)異常反應(yīng)，7d后，每只小鼠體重均較給藥前增加，高、中、低劑量組小鼠體重增加量和增加率與對(duì)照組小鼠相比無(wú)顯著性差異（表1）。

3討論

疫苗以技術(shù)水平劃分，可分為第一代完整病原體疫苗（減毒的活疫苗及滅活疫苗）、第二代分子技術(shù)亞單位疫苗和第三代基因工程疫苗 [19]。部分第一代、第二代疫苗免疫效果不明顯，且在激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)之前有降解的可能性，使其應(yīng)用受到了限制 [21-24]。目前，第三代基因工程疫苗是疫苗研發(fā)中的重點(diǎn)，而黏膜免疫活載體疫苗作為基因工程疫苗中非常重要的一類(lèi)，由于其可在黏膜表面接種激發(fā)作為機(jī)體第一道屏障的黏膜免疫以阻止病原微生物的入侵，故成為基因工程疫苗研發(fā)中的熱點(diǎn) [25]。

目前活載體疫苗研究最多的是致弱病原菌載體，如分枝桿菌（mycobacteria） [26]、沙門(mén)氏菌（salmonlla） [27]。但因其仍可能保持侵襲性和毒性，對(duì)兒童、老人及部分免疫缺陷者有潛在的危險(xiǎn)，此外，過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答會(huì)降低后繼疫苗的效力，因此，其在應(yīng)用上受到了限制。

利用乳酸乳球菌作為抗原遞呈載體能夠克服上述缺陷。乳酸乳球菌是安全級(jí)的微生物，在基因工程活載體疫苗的研發(fā)上具有很多天然的優(yōu)勢(shì)：首先，它不是人和動(dòng)物腸道內(nèi)固有菌，不會(huì)在腸道內(nèi)定居，免疫原性小，不會(huì)造成免疫麻痹，可重復(fù)免疫；其次，乳酸乳球菌自身攜帶多種成分可參與免疫修飾，可作為佐劑激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，激發(fā)體液及細(xì)胞免疫；第三，乳酸乳球菌分泌蛋白較少，且不分泌胞外蛋白酶，因此，表達(dá)的外源蛋白易于純化且能保持天然的活性；最后，乳酸乳球菌易于馴化，相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建技術(shù)比較成熟 [28]。

該研究對(duì)前期構(gòu)建的表達(dá)金黃色葡萄球菌纖黏蛋白原凝集素A（ClfA）的重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株進(jìn)行異常毒性的評(píng)價(jià)研究。該研究設(shè)置了高、中、低劑量組，分別腹腔注射1.0×10 8、2.0×10 7、4.0×10 4CFU/ml重組乳酸乳球菌氯化鈉混懸液0.5ml，相當(dāng)于人體每天建議用量的2500、500和1倍。結(jié)果表明，重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株對(duì)動(dòng)物體無(wú)明顯可見(jiàn)的異常毒性作用。重組乳酸乳球菌在制備基因工程活載體疫苗和新型免疫型微生態(tài)制劑方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

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