史芳芳

摘要[目的]通過對反應(yīng)條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RTPCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)2種病毒的同時高效快速檢測。[方法]通過CTAB法與試劑盒提取RNA，以優(yōu)質(zhì)的總RNA為模板，進(jìn)行梯度PCR，結(jié)合擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的檢測體系，建立多重RTPCR檢測方法。[結(jié)果]建立了優(yōu)化的SCV和SVBV的多重RTPCR檢測體系，可以對草莓田間植株進(jìn)行快速穩(wěn)定的病毒檢測。[結(jié)論]該研究為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學(xué)方法，為草莓無病毒苗的實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞草莓病毒；內(nèi)標(biāo)；多重RTPCR；病毒檢測

中圖分類號S41-33文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）28-020-02

Throughoptimizationofreactionconditionsandparameters，multipleRTPCRdetectionmethodwasestablishedinordertorealizeefficientandrapiddetectionoftwokindsofvirus.[Method]ByCTABmethodandthekit，RNAwasextracted.UsinghighqualitytotalRNAasatemplate，gradientPCRwasdone，Combiningwithinternalamplificationtargetdetectionsystem，amultiplexRTPCRdetectionsystemofSCVandSVBVwasestablished.[Result]AmultiplexRTPCRdetectionsystemofSCVandSVBVwasestablished，andcouldmakefastandstablevirusdetectioninfieldgrownstrawberries.[Couclusion]Thestudyprovidedaconvenientandefficientmolecularbiologymethodforstrawberryvirusdetection，andprovidedtechnicalsupportforactualproductionofstrawberryvirusfreeseedling.

KeywordsStrawberryvirus；Internalcontrol；MultiplexRTPCR；Virusdetection

草莓種苗普遍感染病毒是草莓生產(chǎn)中的瓶頸問題，由于可侵染草莓的病毒經(jīng)常復(fù)合侵染，因此草莓病毒病的田間癥狀表現(xiàn)極其復(fù)雜 [1]。不同病毒病在草莓上可表現(xiàn)出相似的癥狀，而同種病毒病在不同條件下的癥狀也會出現(xiàn)很大差異，這給病害的田間診斷帶來了極大的困難 [2]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的草莓病毒檢測技術(shù)具有重要的實(shí)際意義。目前新疆關(guān)于草莓病毒病的研究極少，對病毒種類、分布、發(fā)生程度及生物學(xué)特性等基礎(chǔ)研究極為薄弱，病毒檢測體系不健全，缺乏先進(jìn)的種苗及種苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)有效的病毒檢測技術(shù)手段，脫毒種苗質(zhì)量難以保證，退化嚴(yán)重，使用時間短，效益不高。有的生產(chǎn)單位未經(jīng)檢測就盲目從內(nèi)地調(diào)種，劣質(zhì)種苗不僅破壞了脫毒種苗的聲譽(yù)，損害了農(nóng)民的利益，還造成了一些病原菌的廣泛傳播和地區(qū)性的檢疫病害傳入 [3]。因此，在已有試驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步改進(jìn)試驗(yàn)方法，優(yōu)化體系，建立起一套靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡便的病毒檢測技術(shù) [4]。筆者針對草莓皺縮病毒（SCV）和草莓鑲脈病毒（SVBV）2種病毒，以單一RTPCR為基礎(chǔ)，通過對反應(yīng)條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RTPCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)2種病毒的同時高效快速檢測，為草莓病毒檢測提供一種方便、高效的分子生物學(xué)方法，為草莓無病毒苗的實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

草莓試材為新疆兵團(tuán)十二師三坪農(nóng)場種植的露地草莓品種達(dá)賽萊克特，此品種為該單位從外地引進(jìn)，種苗未經(jīng)檢測種植于大田，采集疑似感染皺縮病毒的6株草莓植株葉片，進(jìn)行病毒檢測。取約50mg幼葉為試驗(yàn)材料。

1.2試驗(yàn)試劑RNA試劑提取盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均購于上海生物工程有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1特異性擴(kuò)增與參照引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中SMoV（GenbankAccessionNo.AJ311875，AJ311876）、SMYEV（GenbankAccessionNo.D12517）、SCV（GenbankAccessionNo.AY005146.1）、SVBV（GenbankAccessionNo.NC001725）的基因組序列和文獻(xiàn)分別設(shè)計(jì)和合成針對SMoV、SMYEV、SCV和SVBV的引物（表1） [5]。

為了驗(yàn)證擴(kuò)增的陰性條帶的真?zhèn)涡裕貌葺拥鞍谆駻ctin（GenBankAccessionNo.AB116565）作為內(nèi)部體系參照 [6]。所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見表1。

1.3.2核酸提取。

1.3.2.1利用改進(jìn)的CTAB法提取草莓葉片總核酸 [7]。取少許幼嫩葉片，放入1.5ml離心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均勻，直至全部研磨至粉末，加入500μl65℃預(yù)熱的CTAB溶液（用前加入2%的巰基乙醇），將裝有CTAB和樣品的EP管放入65℃水浴，約20min。冷卻后，加入500μl酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，12000r/min，離心15min，吸上清，裝入一新的EP管。加入500ul氯仿∶異戊醇（24∶1），12000r/min，離心15min，吸上清，轉(zhuǎn)入一新的離心管中。加入1/10體積的NaAc（3mol/L），1ml-20℃預(yù)冷的無水乙醇，反復(fù)顛倒數(shù)次，混勻后置于-20℃（-80℃，30min）3～4h，12000r/min，10min，棄上清。向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。加入DEPCH2O（30μl）溶解。

1.3.2.2試劑盒提取總RNA。總RNA的提取參見試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4梯度PCR擴(kuò)增內(nèi)參。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。PCR體系：

10×PCR緩沖液4μl，

MgCl21.2μl，

dNTPs0.4μl，

引物ActinF/ActinR1μl，

Taq酶0.5μl，

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，補(bǔ)足雙蒸水至20μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min；94℃30s，50～55℃40s，68℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.3.5多重RTPCR。

1.3.5.1雙重RTPCR擴(kuò)增SCV。擴(kuò)增體系：

10×PCR緩沖液4μl，MgCl21.2μl，dNTPs0.4μl，引物ActinF/ActinR0.5μl，SCVF/SCVR0.5μl，Taq酶0.5μl，

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，

補(bǔ)足雙蒸水至20μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min；94℃30s，55℃40s，68℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.3.5.2三重RTPCR擴(kuò)增其他3個病毒。

擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液4μl，MgCl21.2μl，dNTPs0.4μl，

引物

SMoVF/SMoVR0.72μl，SVBVF/SVBVR1μl，SMYEVF/SMYEVF0.6μl，Taq酶0.5μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，

補(bǔ)足雙蒸水至20μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min；94℃30s，55℃40s，68℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

2結(jié)果與分析

2.1總核酸分離和電泳檢測

采用試劑盒提取總核酸，包括總DNA和總RNA。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出（圖1），DNA條帶及RNA的28S、18S和5S條帶均能看到，這說明總RNA沒有發(fā)生降解，完整性較好。

2.2內(nèi)標(biāo)RTPCR

以ActinF/ActinR為引物，采取草莓品種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，梯度PCR擴(kuò)增，篩選出53°為最佳退火溫度，擴(kuò)增出預(yù)期295bp大小的特異片段（圖2），說明Actin基因存在于草莓中，該基因適合作為草莓RNA病毒檢測的內(nèi)標(biāo)。以此基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，一方面可以排除假陰性結(jié)果的干擾，另一方面可以進(jìn)一步檢測RNA質(zhì)量，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3多重RTPCR

以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR兩對引物首先擴(kuò)增疑似皺縮病毒，擴(kuò)增條件同Actin基因，2個植株擴(kuò)增出大小為345bp的特異片段（圖3），說明檢測出SCV病毒，此前預(yù)估帶有此病毒的推測是正確的。

同時，以另外3種病毒引物繼續(xù)擴(kuò)增cDNA，確定植株是否還有其他病毒侵染，結(jié)果檢測出片段大小278bp的條帶，說明存在鑲脈病毒侵染（圖4），因此疑似植株可確定為皺縮病毒和鑲脈病毒復(fù)合侵染，與皺縮病毒通常與草莓鑲脈病毒（SVBV）復(fù)合侵染的說法一致。

3討論

（1）與改進(jìn)CTAB法提取RNA相比，該研究采用試劑盒提取，方法簡單，只需30min，提取效果也比改進(jìn)的CTAB法好，而且改進(jìn)的CTAB法提取配制試劑復(fù)雜，準(zhǔn)備工作耗時長，對所用耗材及試劑要求均必須去除RNA酶污染，提取時

間需要12h，提取過程也較繁瑣，一批次提取樣品，提取效果均一性不好，有些樣品提取條帶完整，有些則效果較差，這說明提取過程稍不注意，則會有RNA酶污染，影響了提取效果 [8]。

（2）植物病毒檢測體系中引入內(nèi)標(biāo)可增加試驗(yàn)的可靠性，減少假陰性的出現(xiàn)。該研究設(shè)計(jì)了NADH脫氫酶基因?yàn)閮?nèi)參，合成引物后，經(jīng)過多次條件摸索，始終擴(kuò)增不出內(nèi)參條帶，之后換成Actin內(nèi)參引物，經(jīng)過梯度PCR擴(kuò)增，一次便成功擴(kuò)增出條帶，該研究最終選擇此基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增效果較好，健康植株與帶毒試材均可良好地擴(kuò)增，說明此內(nèi)標(biāo)相對穩(wěn)定 [9]。

（3）多重PCR擴(kuò)增受諸多因素影響，該研究首先以疑似病毒引物和內(nèi)參引物作雙重PCR擴(kuò)增，確保了樣本RNA質(zhì)量的可靠性，同時驗(yàn)證了疑似病毒的檢測結(jié)果，2次試驗(yàn)再進(jìn)行三引物PCR擴(kuò)增，以排除其他病毒的侵染，2次試驗(yàn)便可確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確無誤，避免了單一引物擴(kuò)增的繁瑣性，因此，經(jīng)過多重RTPCR擴(kuò)增可縮短試驗(yàn)時間，減少試劑的損耗，達(dá)到了省時省力的功效。同時，該研究在試驗(yàn)過程中嘗試了采用一步法RTPCR進(jìn)行擴(kuò)增，此方法可節(jié)省更多的時間和試驗(yàn)步驟，但此方法中間過程不易控制，且重復(fù)性不好，因此沒有得到較好的試驗(yàn)結(jié)果，最終還是選擇兩步法PCR更能保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性 [10]。

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