吳青青 等

摘要[目的]為利用百合未減數(shù)花粉進(jìn)行有性多倍化育種。[方法]利用流式細(xì)胞儀測(cè)定百合花粉的倍性，以Marlon、Viviana的花粉為材料，以葉片為對(duì)照，比較兩種不同細(xì)胞核提取液的效果差異。[結(jié)果]CyStainUVPreciseT提取液明顯優(yōu)于WPB提取液；Marlon、Vivian葉片測(cè)定結(jié)果顯示其為二倍體，花粉測(cè)定的圖像顯示兩個(gè)品種都能自發(fā)產(chǎn)生2n花粉。[結(jié)論]流式細(xì)胞儀可以快速地測(cè)定百合花粉的倍性。

關(guān)鍵詞流式細(xì)胞儀；百合；花粉；倍性

中圖分類號(hào)S603文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）28-004-03

StudyonDeterminationofLiliumPollenPloidybyFlowCytometry

WUQingqing 1，HUXiaojing 2，HUANGWei 1*etal

（1.HorticultureResearchInstituteofGuizhou，Guiyang，Guizhou550006；2.CollegeofHorticulture，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550006）

Abstract[Objective]Fortheuseoflihiumunreducedpollentosexualpolyploidizationbreeding.[Method]WemadeuseofflowcytometrytodetermineliliumpollenploidybytakingthepollenofMarlonandVivianaasmaterialsandleavesforcomparison.[Result]Bycomparingtheeffectdifferenceoftwodifferentcellnuclearextracts，theextractofCyStainUVPreciseTwassignificantlybetterthanthatofWPB.MarlonandVivianaleavesmeasurementresultsshowedthattheywerediploidsandthepollenmeasurementimageshowedthetwovarietiescouldproduce2npollenontheirown.[Conclusion]Flowcytometrycanbeusedtoquicklymeasureliliumpollenploidy.

KeywordsFlowcytometry；Lily；Pollen；Ploidy

百合為百合科百合屬多年生球根花卉，性喜高原山地冷涼氣候。野生種在我國(guó)云貴高原等海拔2000m左右地區(qū)廣泛分布，其切花商業(yè)品種也多種植于海拔2300m左右的地區(qū)。

百合商業(yè)品種是全球花卉市場(chǎng)主流切花之一，受到歐美、亞洲消費(fèi)者的廣泛喜愛，具有廣闊的市場(chǎng)。百合商業(yè)品種有高度雜合性，染色體同源性較差。這些雜交種通常都會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生未減數(shù)花粉。這些花粉很多能夠正常萌發(fā)，可以作為有性多倍化育種的材料，用于雜交授粉 [1-5]。

流式細(xì)胞技術(shù)（Flowcytometry）是20世紀(jì)80年代興起的新技術(shù)，有快速、簡(jiǎn)單、通量大的特點(diǎn)，被廣泛地用于基礎(chǔ)研究。流式細(xì)胞儀常被用于鑒定植物的倍性，通過檢測(cè)植株G0/G1峰的核酸含量可以判斷出植物的倍性 [6-13]。將流式細(xì)胞儀用于百合花粉倍性的檢測(cè)，可以快速地知道某一品種是否能產(chǎn)生未減數(shù)花粉，之后則可以通過一些技術(shù)手段對(duì)花粉進(jìn)行分離，篩選出未減數(shù)花粉用于雜交授粉。百合花粉一般為橢圓形，長(zhǎng)徑在100μm左右，體積微小，花粉壁較厚，將之破碎后釋放出足夠量的游離細(xì)胞核用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)較困難。筆者借鑒了同行經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出適合的方法，能夠較方便地制備百合花粉細(xì)胞核懸浮液，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為2個(gè)百合商業(yè)品種Marlon、Viviana花粉，以各自葉片為對(duì)照。所有材料均種植于貴州省園藝研究所花卉大棚。流式細(xì)胞儀為Partec公司生產(chǎn)CyFlowSpace，染色液為Partec公司生產(chǎn)的CyStainUVPloidyDAPIStainingSolution。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

樣品采集。采集葉片，放入冰盒中帶回試驗(yàn)室，清洗干凈后晾干，備用；在百合花朵完全綻放后，用小塑料袋收集已成熟的花粉，做好標(biāo)記，并帶回試驗(yàn)室，然后將花粉平鋪在培養(yǎng)皿中，放在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2

細(xì)胞核的提取和染色。使用WPB（WoodyPlantBuffer）和CyStaninUVPreciseT兩種提取液制備Marlon葉片細(xì)胞核懸浮液，比較試驗(yàn)效果。CyStainUVPreciseT購自于Partec公司；

WPB含濃度1%PVP10、0.2mol/LTrisHCl、2mmol/LNa2EDTA、4mmol/LMgCl2、10mmol/LSodiummetabisulfite、86mmol/LNaCl、1%（V/V）TritonX100，pH7.5 [14]。

1.2.3

葉片細(xì)胞核懸浮液制備方法。在6cm玻璃培養(yǎng)皿中加入0.5cm*0.5cm大小鮮嫩葉片，滴加400μl細(xì)胞核提取液浸沒樣品，用鋒利刀片切碎葉片至糊狀加入2ml染色液染色后，30μm篩網(wǎng)過濾，上機(jī)測(cè)定。

1.2.4

花粉細(xì)胞核懸浮液制備方法。在6cm玻璃培養(yǎng)皿中加入大量花粉，最好為干燥過的花朵，滴加400μl的CyStaninUVPreciseT細(xì)胞核提取液浸沒樣品，攪拌均勻后靜置5～20min，待成糊狀后用鋒利刀片反復(fù)砍切20min，加入2ml染色液染色后，30μm篩網(wǎng)過濾，上機(jī)測(cè)定。同時(shí)，可斟量添加染色液以保證細(xì)胞核濃度。

1.2.5流式細(xì)胞儀倍性測(cè)定。DAPI染色的雙鏈核酸在365nm的激光下激發(fā)放出藍(lán)色熒光，設(shè)置增益電壓為268，上樣測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞核提取液對(duì)倍性測(cè)定的影響

利用兩種不同的提取液處理Marlon葉片，得到細(xì)胞核懸浮液。加入染色液染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由圖1、2可知，在由WPB提取液得到的圖像上能夠看到G0/G1峰，但并不明顯，細(xì)胞碎片較多，對(duì)G0/G1峰的下部有所掩蓋；在用CyStainUVPreciseT提取液得到的圖像上G0/G1峰清晰，細(xì)胞碎片相對(duì)較少，試驗(yàn)效果明顯優(yōu)于WPB提取液。

2.2葉片倍性的測(cè)定

Marlon、Viviana葉片利用CyStainUVPreciseT提取液制備細(xì)胞核懸浮液，上機(jī)測(cè)定，以此作為花粉倍性測(cè)定的對(duì)照。由圖1、3可知，兩個(gè)百合品種都是二倍體，GO/G1峰在橫坐標(biāo)100左側(cè)，MarlonGO/G1峰的橫坐標(biāo)平均數(shù)為84.65，CV值為9.88%，Viviana為80.5CV值為11.13%。Marlon為OT遠(yuǎn)緣雜交種，Viviana為O雜交種，都是近幾年剛培育出的新品種。

2.3花粉倍性的測(cè)定

利用CyStainUVPreciseT提取液制備花粉細(xì)胞核懸浮液，上機(jī)檢測(cè)。由圖4、5可知，除了單倍體峰，在兩份花粉中都檢測(cè)出二倍體峰。百合為二細(xì)胞花粉，包含一個(gè)大的單倍體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)小的單倍體生殖細(xì)胞，在經(jīng)過花粉破碎、細(xì)胞核提取液的裂解以及30μm篩網(wǎng)過濾之后基本得到的懸浮液都應(yīng)該是單一的細(xì)胞核和較小的細(xì)胞碎片，此時(shí)出現(xiàn)的二倍體峰應(yīng)該為2n花粉細(xì)胞核所產(chǎn)生的信號(hào)，也就是說，這兩個(gè)品種都可以自發(fā)地產(chǎn)生2n配子。據(jù)圖像，發(fā)現(xiàn)Marlon花粉單倍體峰的橫坐標(biāo)平均數(shù)為49.52，CV值為7.83%，二倍體峰為92.03，CV值為12.29%；Viviana為單倍體峰為38.90，CV值為8.51%，二倍體峰為72.46，CV值為8.17%。CV值表示取樣的異質(zhì)性，CV值越高則表示取樣同質(zhì)性差。

Marlon花粉二倍體峰底部向橫坐標(biāo)右側(cè)有延伸。這部分可能是雜質(zhì)信號(hào)，也可能是其他倍性的花粉細(xì)胞核信號(hào)，影響二倍體峰的分析數(shù)據(jù)，使得平均值大于二倍體葉片的數(shù)值，但從主峰的位置上來看與葉片的GO/G1峰是吻合的。

Viviana的二倍體峰平均值則略小于葉片數(shù)值。這是由二倍體峰和單倍體峰之間的細(xì)胞核信號(hào)較多造成的。這些信號(hào)可能是由非整倍體花粉造成的。單獨(dú)取出Viviana的二倍體主峰進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)平均值為82.89，CV值為24.02%，其數(shù)值基本與二倍體葉片相當(dāng)。

3討論

百合花粉較難破碎。如何有效地破碎花粉壁是保證試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵問題。在試驗(yàn)初期階段，筆者嘗試了液氮、砂紙、離心等手段，但效果都不好，最后還是采用刀片砍切的辦法，操作簡(jiǎn)單，但是比較費(fèi)力，需連續(xù)20min才能保證較好的破碎量，花粉需求量也較大。

對(duì)于葉片雜質(zhì)問題，在制備葉片細(xì)胞核懸浮液的過程中，需要將葉片破碎至糊狀，才能保證懸浮液有合適的細(xì)胞核濃度，造成懸浮液中細(xì)胞碎片較多。研究表明，在GO/G1峰左側(cè)能夠看到大量明顯的雜質(zhì)信號(hào)。這些雜質(zhì)信號(hào)在進(jìn)行分析時(shí)會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要對(duì)其進(jìn)行遮擋。

對(duì)于流速與密度問題，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力是有限的，在每秒通過信號(hào)數(shù)超過一定值的情況下，檢測(cè)到的信號(hào)會(huì)被削弱。比如，在相同上樣流速的情況下，信號(hào)密度為30個(gè)/s，峰所在的位置橫坐標(biāo)值為85，如果信號(hào)密度達(dá)到350個(gè)/s，那么峰所在的位置橫坐標(biāo)值會(huì)降低到55?？紤]到這種情況，筆者對(duì)樣品濃度和上樣流速都提出要求。如果樣品濃度過高，則很可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，同理在高流速下，單位時(shí)間經(jīng)過的樣品數(shù)量過高，就等同于提高檢測(cè)樣品的濃度，必然也會(huì)影響熒光信號(hào)的數(shù)值。這個(gè)問題根源還是由于流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力有限。

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