劉曉妹等

摘 要 由多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產(chǎn)膠量的主要病害之一。為了開展該病原菌在活體葉片中的病理學(xué)研究，本實(shí)驗(yàn)將綠色熒光蛋白gfp基因表達(dá)盒插入了多主棒孢菌經(jīng)定點(diǎn)突變后的ITS序列中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pITGH，并經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化了原生質(zhì)體，獲得了GFP標(biāo)記的多主棒孢菌轉(zhuǎn)化子，所獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過連續(xù)7次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌絲中穩(wěn)定地發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，其生長(zhǎng)特性和致病性與野生菌株無明顯差異。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；多主棒孢菌；綠色熒光蛋白；ITS定點(diǎn)突變；標(biāo)記

中圖分類號(hào) S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Corynespora leaf fall（CLF）disease， caused by the fungal pathogen Corynespora cassiicola， is a major disease of rubber tree（Hevea brasiliensis）that affects the production of natural rubber. The objective of this paper was to provide desired materials for studing pathogenesis on living leaves. The green fluorescent protein（GFP）-expression vector pITGH was constructed by inserting a gfp cassette into rDNA-ITS of site-directed mutagenesis. C. cassiicola protoplasts were transformed by pITGH using a PEG-mediated method. A GFP-tagged transformat was gained. The transformation was efficient， and GFP expression remained stable for at least seven subcultures with fluorescence clearly visible in both the hyphae and spores. The transformed isolate also retained its pathogenicity and growth pattern， both similar to those of wild type. This result would be useful for understand biology，observing infection process， predicting the CLF disease and evaluating resistance of H. brasiliensis to C. cassiicola by means of leaf colonization studies.

Key words Hevea brasiliensis； Corynespora cassiicola； GFP； rDNA-ITS of site-directed mutagenesis； Marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.022

巴西橡膠樹是重要的熱帶作物之一，其產(chǎn)品天然橡膠與鋼鐵、石油、煤炭并列為四大工業(yè)原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.） Wei]侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產(chǎn)膠量的主要病害之一[1]。該病菌能侵染為害280多種植物[2]。關(guān)于該病菌的生物學(xué)特性、遺傳多樣性以及病害防治等方面已開展了較多研究[3-4]，而且已深入到分子研究水平，已報(bào)道了4個(gè)致病相關(guān)基因CCK1[3]、CMP1[4]、CCHog1[5]和cas[6]，但有關(guān)該菌GFP標(biāo)記的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

與傳統(tǒng)的組織印跡法、放射性標(biāo)記核酸探針法、GUS染色法等非活體檢測(cè)方法相比，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）因發(fā)光穩(wěn)定、對(duì)活細(xì)胞無傷害和不需添加外源底物，就可以在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[7]，利用GFP標(biāo)記靶標(biāo)植物病原菌成為了目前研究病原菌與寄主之間互作的重要手段[8]，迄今已標(biāo)記成功的植物病原菌有芒果尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）[9]、芒果畸形病病菌（Fusarium proliferatum）[10]、香蕉、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[11-13]、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）[14]、棉花黃萎病菌（Verticillium dahlia）[15]、西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）[16]等，極大地便利了這些病原菌在定植、組織侵染過程及品種侵染差異性等方面的研究。GFP也被廣泛用于標(biāo)記病原菌的致病相關(guān)基因[17-18]，為研究其時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，揭示病原菌致病機(jī)理提供了有利的手段。為了在活體寄主上研究多主棒孢菌與巴西橡膠樹葉片的互作關(guān)系，本研究擬通過定點(diǎn)突變ITS序列和PEG介導(dǎo)途徑，將多主棒孢菌構(gòu)建成了能發(fā)出綠色熒光的標(biāo)記菌株，以期為下一步研究該病菌在活體橡膠葉片上的生物學(xué)、侵染過程、預(yù)測(cè)病害和篩選抗病品種等打下良好的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌和質(zhì)粒 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.）Wei]單孢菌株CC004，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。潮霉素B（HmB）抗性基因hygB來源于質(zhì)粒pCT74[8]，由美國(guó)Oregon大學(xué)Ciuffetti博士提供。

1.1.2 供試藥劑和培養(yǎng)基 Fungal gDNA Kit、Mini Plasmid Kit為BioMiga產(chǎn)品；pMD18-T simple vector、E. coli JM109、X-Gal、IPTG、XhoⅠ、EcoRⅠ、Marker DL 2 000、Marker DL 15 000均為TaKaRa產(chǎn)品；2×HS Taq-Mixture Kit、TIANgel Midi Purification Kit為TIANGENE產(chǎn)品。潮霉素B為Roche進(jìn)口分裝，Ampicillin為Amresco進(jìn)口分裝。溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所。用于制備PDA、PDS、PD培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)基的試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 GFP標(biāo)記多主棒孢菌的策略與方法 從pCT74質(zhì)粒上酶切hygB：：gfp片段需要限制性內(nèi)切酶XhoⅠ（CTCGAG）和EcoRⅠ。在CC004菌株的ITS序列上[4]，只存在EcoRⅠ，而無XhoⅠ位點(diǎn)，但在第324～329位點(diǎn)有與XhoⅠ位點(diǎn)相似的序列TTCGAG，若通過設(shè)計(jì)引物（5ITG-F/5ITG-R、3ITG-F/3ITG-R、C-ITG-F/C-ITG-R），將該位點(diǎn)的堿基T定點(diǎn)突變?yōu)镃，即可獲得含XhoⅠ酶切位點(diǎn)的ITS新序列（命名ITG）。將ITG克隆至pMD18T-simple vector上（pITG），再用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pITG和pCT74，回收線性化pITG和hygB：：gfp片段，通過T4連接酶將hygB：：gfp插入pITG，即可獲得重組質(zhì)粒pITGH。再用pITGH轉(zhuǎn)化CC004菌株原生質(zhì)體，因其hygB：：gfp兩側(cè)為ITS部分序列，所以可通過同源重組將hygB：：gfp整合入CC004菌株的ITS序列上，最終獲得gfp標(biāo)記的多主棒孢菌（圖1）。引物見表1，擴(kuò)增體系（50 μL）：2×HS Taq Mixture 25.0 μL，上/下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，模板1.0 μL（擴(kuò)增5ITG和3ITG片段時(shí)以CC004菌株總DNA為模板，擴(kuò)增ITG片段時(shí)以回收的5ITG和3ITG產(chǎn)物為模板），ddH2O 20.0 μL。5ITG、3ITG、ITG片段擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火溫度（Tm）及時(shí)間（t）見表1，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。gfp檢測(cè)程序：96 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。其余操作見相應(yīng)試劑盒。

1.2.2 重組質(zhì)粒pITGH的PCR鑒定 用pMD18-T simple vector通用引物RV-M/M13-47檢測(cè)，并將符合預(yù)期的重組質(zhì)粒寄往深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)序列的正確性。

1.3 pITGH轉(zhuǎn)化多主棒孢菌菌株CC004原生質(zhì)體

1.3.1 CC004菌株對(duì)潮霉素B的敏感性測(cè)定 在含20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的Hm B的PDA培養(yǎng)基上接種菌餅，28 ℃培養(yǎng)7 d，確定Hm B對(duì)CC004菌株的最低抑菌濃度。

1.3.2 CC004菌株原生質(zhì)體制備及其PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化與再生 參考劉曉妹[3]的方法，制備CC004菌株原生質(zhì)體，使其濃度為2×107～3×107個(gè)/mL，立即轉(zhuǎn)化，即在10 mL無菌尖底離心管中，加入100 μL原生質(zhì)體、40 μL pITGH質(zhì)粒、50 μL 2×STC溶液，輕輕混勻后，冰浴20 min，加入2 mL 60% PEG 4000溶液，輕輕混勻，室溫放置10～20 min，再加入適量PDS 再生培養(yǎng)液，使最終總體積為5 mL，輕輕混勻，封口后在28 ℃培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)36 h，取1 mL涂抹于含80 μg/mL Hm B和適量鏈霉素的PDS平板上，共涂抹5皿，28 ℃黑暗培養(yǎng)10～15 d后，挑取單菌落在激光共聚焦顯微鏡下鏡檢熒光。

1.3.3 GFP標(biāo)記菌株的熒光穩(wěn)定性檢測(cè) 選擇綠色熒光最強(qiáng)的菌落，單孢純化后在不含Hm B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)7次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，在培養(yǎng)的初期（2 d）、中期（5 d）和后期（10 d），鏡檢其熒光穩(wěn)定性并拍照。

1.3.4 GFP標(biāo)記菌株的PCR鑒定 先用gfp基因特異性引物P28、P29檢測(cè)1.3.3獲得的單孢菌株，再?gòu)牟迦肫蔚耐鈧?cè)ITS序列上設(shè)計(jì)引物，即標(biāo)記菌株特異性檢測(cè)引物ITSHG-F/ITSHG-R，檢測(cè)并測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物，以證實(shí)hygB：：gfp基因插入了標(biāo)記菌株的ITS序列中。

1.3.5 GFP標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)觀察和致病性測(cè)定

將標(biāo)記菌株和野生型菌株在不含Hm B的PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察菌落形態(tài)和大小。再用無菌水洗下配成2 000個(gè)孢子/mL的懸浮液，刺傷接種巴西橡膠樹感病品種‘RIM600嫩綠色葉片，28 ℃保濕培養(yǎng)，定時(shí)觀察。用無菌水作空白對(duì)照。每處理重復(fù)5片葉。

2 結(jié)果與分析

2.1 多主棒孢菌菌株CC004的5ITG、3ITG和ITG片段擴(kuò)增結(jié)果

圖2表明，5ITG、3ITG、ITG擴(kuò)增條帶的大小分別約為230、280、480 bp ，符合預(yù)期。測(cè)序表明：大小477 bp的ITG序列在第210位點(diǎn)（ITS第324位點(diǎn)）的堿基T被突變?yōu)榱藟A基C，具備了XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。

2.2 重組質(zhì)粒pITGH的PCR鑒定

用引物M13-47和RV-M從重組質(zhì)粒pITGH上擴(kuò)增獲得約3 400 bp的片段（圖3），說明hygB：：gfp（3.0 kb）片段已插入了ITG（477 bp）的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間，測(cè)序表明重組質(zhì)粒pITGH-3序列完全正確，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)化。

2.3 gfp基因轉(zhuǎn)化多主棒孢菌菌株CC004原生質(zhì)體

2.3.1 CC004菌株對(duì)潮霉素B的敏感性測(cè)定

CC004菌株在含Hm B的PDA平板上培養(yǎng)7 d，結(jié)果表明：Hm B對(duì)CC004菌株的最低抑菌濃度為80 μg/mL。

2.3.2 GFP標(biāo)記菌株的熒光穩(wěn)定性檢測(cè) 連續(xù)7次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP標(biāo)記菌株，仍可在培養(yǎng)初期、中期和后期的分生孢子及其萌發(fā)的芽管、分生孢子梗以及菌絲體中觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光（圖4）。說明gfp基因在CC004菌株中能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。

2.3.3 GFP標(biāo)記菌株的PCR鑒定 提取轉(zhuǎn)化子菌株基因組DNA后，用gfp特異性引物P28/P29進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到約400 bp的預(yù)期片段，而在野生菌株中未擴(kuò)增出此條帶（圖5），可見gfp基因已整合到了轉(zhuǎn)化子基因組中。再用標(biāo)記菌株特異性檢測(cè)引物ITSHG-F/ITSHG-R檢測(cè)，在轉(zhuǎn)化子和野生菌株中分別擴(kuò)增到約3 300 bp和520 bp的預(yù)期片段（圖6），說明轉(zhuǎn)化子得到了完全純化，且hygB：：gfp基因插入了標(biāo)記菌株的ITS序列中，此結(jié)果被擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步得到了證實(shí)。

2.3.4 GFP標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)觀察和致病性測(cè)定

由圖7可以看出，GFP標(biāo)記菌株與野生型的菌落形態(tài)和大小略有差別，但差異不明顯；其致病性與野生型菌株也無明顯差別，均能引起典型壞死斑（圖8），說明本試驗(yàn)用GFP標(biāo)記CC004菌株獲得成功。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株在選擇壓為80 μg/mL的Hm B 平板中央都長(zhǎng)出了菌落，幾乎都能發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)化成功率約100%。然而，在培養(yǎng)基邊緣，尤其是培養(yǎng)皿壁上長(zhǎng)出的菌落基本上都不發(fā)光，可能與倒平板時(shí)在邊緣或壁上產(chǎn)生的冷凝水不含Hm B有關(guān)。因此，建議篩選時(shí)應(yīng)以平板中央為主，或涂板時(shí)注意，要盡量在平板中央小范圍涂抹，以免濺入冷凝水中生長(zhǎng)，造成假陽(yáng)性。

人們普遍采用含綠色熒光蛋白基因gfp的載體如pCT74轉(zhuǎn)化目標(biāo)菌的方法來標(biāo)記目標(biāo)菌[9-10，12]，但其隨機(jī)性強(qiáng)，有可能會(huì)將gfp基因插入到目標(biāo)菌的一些功能基因組上而破壞了這些基因的正常表達(dá)和調(diào)控，進(jìn)而影響到后續(xù)研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。rDNA-ITS序列是真核生物核糖體上5.8 S rDNA和18 S rDNA之間的插入間隔序列，為冗余功能的保守重復(fù)序列。本研究利用定點(diǎn)突變改造ITS序列后，構(gòu)建了gfp標(biāo)記載體pITGH，借助該載體上兩側(cè)的ITS部分序列，通過同源重組將hygB：：gfp基因標(biāo)記到CC004菌株的ITS序列上，不僅充分利用了ITS多拷貝、易克隆等優(yōu)點(diǎn)、提高了標(biāo)記成功率，同時(shí)又降低了因隨機(jī)插入產(chǎn)生不良影響的概率，所獲得的標(biāo)記菌株更能代表野生型菌株的原始特性，值得推薦。

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