曹懷宇 成雪梅 魏磊彬

結(jié)直腸癌是消化道中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究，通過(guò)測(cè)定微血管密度(MVD)，發(fā)現(xiàn)腫瘤中新生血管數(shù)量越多癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性越大［1］;研究表明，VEGF-D與受體結(jié)合后，能起到促進(jìn)細(xì)胞分裂，毛細(xì)血管擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和提高血管通透性的作用［2］。同時(shí)，VEGF-D 還能增加淋巴管系統(tǒng)的通透性，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管。有關(guān)結(jié)直腸癌中VEGF-D 表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少。本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中VEGF-D 表達(dá)情況并探討其與MVD 的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008 至2012 年在中國(guó)人民解放軍第251 醫(yī)院就診的的原發(fā)性結(jié)直腸癌術(shù)后標(biāo)本60 例，均有明確的病理組織學(xué)診斷結(jié)果，所有患者在術(shù)前均未經(jīng)任何治療，所有病例資料完整。60 例結(jié)直腸癌患者中，男35 例，女25 例;年齡45 ～65 歲。臨床分型:隆起型10 例，潰瘍型36 例，浸潤(rùn)型5 例，其他類(lèi)型9 例;組織學(xué)類(lèi)型依照2003 版美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi):高分化腺癌14 例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌23 例;根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(2003)分期:Ⅰ期的5 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期20 例，Ⅳ期18 例。病理證實(shí)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18 例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移42 例。

1.2 試劑 鼠抗人VEGF-D 單克隆抗體:美國(guó)R ＆D公司、LSAB 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 將所選取的病例標(biāo)本常規(guī)行HE 染色確定病理類(lèi)型。免疫組化染色程序按LSAB 免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，以福州邁新公司提供的陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 VEGF-D 的蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒記為陽(yáng)性細(xì)胞，依陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比和著色的強(qiáng)度來(lái)綜合計(jì)分。由兩位高年資病理醫(yī)師分別雙盲閱片，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量記為0 ～3 分，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為＜10%為0 分，10% ～50%為1 分，51% ～75%為2 分，＞75%為3 分;按著色強(qiáng)度記為0 ～3 分，即無(wú)色為0分，灰黃色為1 分，金黃色為2 分，棕黃色為3 分;最后，將兩項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分相加，根據(jù)總的分?jǐn)?shù)分為2 級(jí)，0～2 分為陰性，≥3 分為陽(yáng)性。微血管計(jì)數(shù)參照Weidner 方法［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-D 在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá) VEGF-D蛋白在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、正常組織標(biāo)本中的陽(yáng)性率分別是75.0%、40.0%和20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 VEGF-D 在結(jié)直腸黏膜、腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)例

2.2 VEGF-D 的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床、病理特征間的關(guān)系 VEGF-D 的陽(yáng)性表達(dá)均與患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 VEGF-D 的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

VEGF-D 基因位于染色體Xp22-23，含有8 個(gè)半胱氨酸殘基。人VEGF-D 的cDNA 序列含有419 個(gè)堿基對(duì)，其中的開(kāi)放閱讀框架編碼一種含有354 個(gè)氨基酸的多肽，該多肽被命名為VEGF-D 蛋白。VEGF-D可與VEGFR-2 和VEGFR-3 結(jié)合，但不能與VEGFR-1結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR-3 通過(guò)與VEGF-D 結(jié)合并被激活，導(dǎo)致淋巴管生成、增生或擴(kuò)張且數(shù)目增加［1］，而淋巴管密度的增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是促進(jìn)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要原因［2，4］。由于VEGF-D 能增加淋巴管道系統(tǒng)的通透性，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管，進(jìn)入淋巴管中的腫瘤細(xì)胞則又通過(guò)胸導(dǎo)管擴(kuò)散到血管系統(tǒng)中，從而間接促進(jìn)了腫瘤的血道轉(zhuǎn)移。

有關(guān)結(jié)直腸癌中VEGF-D 表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少，目前的研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者癌組織中VEGF-D 的表達(dá)增高。Juttner 等［5］通過(guò)分析VEGF-D與VEGFR-3 的染色結(jié)果與患者生存率之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，VEGF-D 陽(yáng)性與降低腫瘤的特異性生存率和降低無(wú)病生存率均呈明顯相關(guān)。多元回歸分析也顯示，VEGF-D 可獨(dú)立的作為消化道腫瘤特異性生存率與無(wú)病生存率的預(yù)后因子。本研究表明，在結(jié)直腸癌組織中VEGF-D 的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于結(jié)直腸腺瘤組織及正常結(jié)直腸黏膜組織。VEGF-D 的表達(dá)與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者VEGF-D 表達(dá)強(qiáng)，與劉寶全等［6］的研究結(jié)果一致。

人類(lèi)VEGF-D 與VEGF-C 的序列有48%相同，牟江洪等［7］的研究認(rèn)為，結(jié)直腸癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，表明癌組織可能存在新生淋巴管，尤其是在結(jié)直腸癌浸潤(rùn)的邊緣區(qū)域，且這些新生淋巴管與VEGF-C和VEGF-D 表達(dá)密切相關(guān)［8］，提示VEGF-C 和VEGFD 可能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌尤其癌周淋巴管生成［3，9，10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，VEGF-C 及VEGF-D 在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)，VEGF-D 在VEGF-C 陽(yáng)性組中的表達(dá)明顯高于其在VEGF-C 陰性組中的表達(dá)，也進(jìn)一步印證了上述學(xué)者的研究結(jié)果。當(dāng)然，VEGF-C 與VEGF-D在結(jié)直腸癌表達(dá)具有相關(guān)性的機(jī)制仍需要大量資料去進(jìn)一步證明及探討。

1 Cross MJ，Dixelius J，Matsumoto T，et al.VEGF-receptor signal transduction.Trends Biochem Sci，2003，28:488-494.

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6 劉寶全，張雅芳，馬晶，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3 在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用.解剖學(xué)報(bào)，2007，38:56-60.

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