張黎明

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的常見惡性骨腫瘤，手術(shù)及新輔助化療是其主要治療手段，但腫瘤早期肺轉(zhuǎn)移及部分患者對(duì)化療耐藥是造成綜合治療效果不佳、患者死亡率高的主要原因［1］。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在骨肉瘤等多種惡性腫瘤組織高表達(dá)，是目前發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因［2］。因此，針對(duì)阻斷腫瘤血管形成的基因靶向治療對(duì)于控制腫瘤局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、提高患者生存率具有重要治療價(jià)值。重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhEndo)是已知具有抗腫瘤作用的血管生成抑制因子［3］，本研究以骨肉瘤MG-63 細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在觀察rhEndo 對(duì)VEGF 蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，為進(jìn)一步探討rhEndo 治療骨肉瘤的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所;兔抗人VEGF 單克隆抗體、鼠抗人βactin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;牛血清白蛋白(BSA)、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO 公司;CCK-8 試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。RT-PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞，每2 ～3 天更換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適匯合時(shí)用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR:Trizol 提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度和濃度。取1 μg 總RNA 用RTPCR 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行后續(xù)PCR 擴(kuò)增。PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。擴(kuò)增完畢后取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析，以VEGF 與β-actin 灰度值的比值來(lái)反映VEGF mRNA 表達(dá)水平。

表1 VEGF、β-actin 引物序列

1.2.3 Western blot:提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h 或4℃過夜，TBST 洗膜3 次，分別加入稀釋后的兔抗人VEGF IgG 和鼠抗人β-actin IgG，室溫孵育2 h 或4℃過夜，TBST 洗膜3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 顯色定影。使用凝膠分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描成像，以VEGF 和βactin 條帶灰度值的比值代表VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn):MG-63 細(xì)胞接種到96 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×104/孔，培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，將100 μl CCK 加入檢測(cè)孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，細(xì)胞相對(duì)增殖率% =實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù):使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin-V+ /PI-比值代表細(xì)胞凋亡率。PBS 洗細(xì)胞2 次，重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106個(gè)/ml，取100 μl 細(xì)胞懸液置于流式管中，加入5 μl annexin V-FITC 和10 μl PI溶液，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min;于管中加入300 μl 結(jié)合緩沖液，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處紅色熒光，以百分?jǐn)?shù)表示凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 Transwell 小室體外遷移實(shí)驗(yàn):細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后消化細(xì)胞，分別用PBS、無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌1次，重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×105個(gè)/ml，將100 μl 細(xì)胞懸液及含10% FBS 的500 μl DMEM 培養(yǎng)基分別接種于上室和下室。37℃培養(yǎng)20 h 后取出小室，棄去上室內(nèi)液體，用棉簽擦拭上室面未遷移的細(xì)胞，下室面用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)基底膜下室10 個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，求取均數(shù)即為穿膜細(xì)胞數(shù)，重復(fù)6 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以± s 表示，采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhEndo 對(duì)細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)的影響首先我們采用RT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測(cè)1、10、20 μg/ml rhEndo 對(duì)細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，隨著rhEndo 濃度增加，VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)量均逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，提 示rhEndo 可呈劑量依賴性的抑制VEGF 表達(dá)。其中20 μg/ml rhEndo 對(duì)VEGF 表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，因此，以下實(shí)驗(yàn)我們選用的rhEndo 濃度為20 μg/ml。順鉑組、rhEndo、rhEndo 聯(lián)合順鉑組VEGF 蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯(lián)合用藥組對(duì)VEGF 表達(dá)的抑制作用更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo 單藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2、3。

表2 rhEndo 對(duì)細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 ± s

表2 rhEndo 對(duì)細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 ± s

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與1 μg/ml rhEndo 組比較，#P ＜0.05;與10 μg/ml rhEndo 組比較，△P ＜0.05

組別 VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組3.21 ±0.28 2.34 ±0.16 1 μg/ml rhEndo 組 2.56 ±0.18* 1.12 ±0.08*10 μg/ml rhEndo 組 1.79 ±0.15＊△ 0.61 ±0.05* #20 μg/ml rhEndo 組 0.96 ±0.08＊△ 0.28 ±0.03＊△

表3 4 組VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

表3 4 組VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與順鉑組和rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組3.21 ±0.28 2.34 ±0.16順鉑組 1.04 ±0.11* 0.32 ±0.06*rhEndo 組 0.96 ±0.08* 0.28 ±0.03*rhEndo 聯(lián)合順鉑組 0.41 ±0.05* # 0.13 ±0.02*#

2.2 細(xì)胞增殖、凋亡情況比較 我們采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖和凋亡情況。結(jié)果顯示，順鉑組、rhEndo 組、rhEndo 聯(lián)合順鉑組細(xì)胞相對(duì)增殖率均較對(duì)照組顯著降低，凋亡率均較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞相對(duì)增殖率和凋亡率變化更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo 單藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表4、圖1。

表4 4 組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較 ± s

表4 4 組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較 ± s

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與順鉑組和rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 相對(duì)增殖率(%)24 h 48 h 72 h 凋亡率(%)1.22±0.03 1.39±0.02 1.51±0.05 0.57±0.01順鉑組 1.15±0.03* 1.31±0.03* 1.37±0.05* 6.74±0.47*rhEndo 組 1.14±0.02* 1.30±0.02* 1.35±0.04* 7.02±0.49*rhEndo 聯(lián)合順鉑組 1.08±0.01* # 1.18±0.03* # 1.20±0.02* # 13.21±1.02*#對(duì)照組

圖1 CCK-8 檢測(cè)各組24 h、48 h 及72 h 增殖情況

2.3 細(xì)胞侵襲遷移情況比較 Transwell 小室體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力。結(jié)果顯示，順鉑組、rhEndo 組、rhEndo 聯(lián)合順鉑組侵襲細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯(lián)合用藥組侵襲細(xì)胞數(shù)降低更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo單藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表5。

表5 4 組細(xì)胞侵襲遷移情況比較 ± s

表5 4 組細(xì)胞侵襲遷移情況比較 ± s

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 侵襲細(xì)胞數(shù)對(duì)照組65.48 ±5.22順鉑組 43.11 ±3.25*rhEndo 組 40.76 ±3.17*rhEndo 聯(lián)合順鉑組 19.53 ±2.04*#

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度極高的原發(fā)性骨腫瘤，其發(fā)病率居兒童、青少年惡性骨腫瘤的首位［4］。經(jīng)截肢進(jìn)行廣泛切除手術(shù)后患者的10 年生存率僅為15%，即使采取聯(lián)合新輔助化療和截肢治療仍不能進(jìn)一步提高患者生存率，這主要是因?yàn)榧s40%的患者已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，這是該病死亡率和復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的主要原因［5，6］。近年來(lái)，有關(guān)骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗轉(zhuǎn)移療法的研究和探索成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，這對(duì)于防治骨肉瘤進(jìn)而提高患者生存率至關(guān)重要。然而，目前尚無(wú)效果理想的抗轉(zhuǎn)移療法。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)及措施是減少肺轉(zhuǎn)移發(fā)生及治療骨肉瘤的關(guān)鍵。

研究顯示，惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移與新生血管的生成密切相關(guān)，不僅為癌細(xì)胞生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，還為癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移提供了血管通路［7］。臨床試驗(yàn)表明，骨肉瘤患者術(shù)后促血管生成因子與血管生成抑制因子表達(dá)失衡，與早期肺轉(zhuǎn)移發(fā)生密切相關(guān)［8］?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)裸鼠圍手術(shù)期抑制新生血管的生成能夠明顯減少腫瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生［9］。VEGF 是腫瘤血管形成中的關(guān)鍵因子，是目前已知作用最強(qiáng)的促血管生成因子。研究顯示VEGF 在胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織異常高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過程［10］。VEGF 通過自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)腫瘤血管形成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)還使血管通透性增加，為癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供血管支持物。Rastogi 等［11，12］采用ELISA 法和免疫組化法檢測(cè)骨肉瘤患者血清和腫瘤組織VEGF 表達(dá)狀況，結(jié)果顯示，與健康正常人比較骨肉瘤患者VEGF 表達(dá)水平顯著增高，化療后患者VEGF 表達(dá)水平明顯降低，且發(fā)生肺轉(zhuǎn)移者VEGF 表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移者，提示VEGF 表達(dá)水平不僅對(duì)于骨肉瘤診斷具有參考價(jià)值，而且可以作為判斷腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。由此可見，靶向VEGF 和血管生成的治療措施具有廣泛的應(yīng)用前景和治療意義。

rhEndo 作為一種新型、強(qiáng)效血管生成抑制劑，已于2005 年上市并廣泛應(yīng)用于骨肉瘤、小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的臨床治療。臨床研究證實(shí)，rhEndo 與化療藥物聯(lián)用能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，改善患者預(yù)后［13］。其作用機(jī)制是通過特異性阻斷VEGF/VEGFR 信號(hào)途徑從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖和遷移以及血管、淋巴管生成，最終產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

本研究中我們采用RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)rhEndo 聯(lián)合順鉑對(duì)骨肉瘤MG-63 細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響以及細(xì)胞體外增殖能力、凋亡情況及遷移能力的變化，由此推斷VEGF 在骨肉瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用，并進(jìn)一步探討rhEndo 治療骨肉瘤的可能作用機(jī)制。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，順鉑組、rhEndo 組以及rhEndo 聯(lián)合順鉑組MG-63 細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白水平均有不同程度降低;與單藥相比，聯(lián)合用藥能夠顯著抑制VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)，較單藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，提示rhEndo 除了作用于腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞外，也能直接下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF 的表達(dá)抑制血管生成。CCK-8 結(jié)果顯示，rhEndo 組、順鉑組及rhEndo 聯(lián)合順鉑組細(xì)胞增殖率均較對(duì)照組降低，細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組升高，表明腫瘤細(xì)胞的增殖力明顯減弱;而聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖率最低，凋亡率最高，較單藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，提示聯(lián)合用藥組抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，rhEndo 組、順鉑組及rhEndo 聯(lián)合順鉑組穿膜細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組減少，表明腫瘤細(xì)胞的侵襲力明顯減弱;而聯(lián)合用藥組穿膜細(xì)胞數(shù)最少，較單藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，提示聯(lián)合用藥組抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲力具有協(xié)同作用。由此可見，rhEndo 聯(lián)合順鉑用藥時(shí)，能進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲﹑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，具有更為顯著的抗腫瘤效應(yīng)。

總之，鑒于VEGF 在骨肉瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，針對(duì)VEGF 的分子靶向治療必將成為抗腫瘤新的研究方向和熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，抗腫瘤血管生成治療對(duì)于骨肉瘤具有顯著療效，重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合順鉑方案可能成為骨肉瘤治療的新策略，尤其對(duì)于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和對(duì)化療耐藥的患者，重組人血管內(nèi)皮抑制素有可能具有更大的治療價(jià)值。

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