李美艷 程利芳 陳輝 陳永學(xué) 呼君瑜 石媛媛 宋春麗 馬利輝 焦茹

腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與、多階段的復(fù)雜過程，與多種細(xì)胞因子有關(guān)［1］。絕大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌為雌激素依賴性腫瘤，與雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)關(guān)系密切。Maspin 作為抑癌基因，Maspin 的低表達(dá)也在子宮內(nèi)膜的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。uPA 為一種絲氨酸蛋白酶，通過細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的脫離、遷徙及侵襲，為子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。本研究應(yīng)用免疫組化SP 法檢測Maspin、uPA、ER、PR 蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及其相關(guān)性，以期了解Maspin、uPA 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用及與雌、孕激素受體之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2004 年6 月至2014 年6 月在邯鄲市中心醫(yī)院病理科存檔的子宮內(nèi)膜癌患者組織蠟塊50 例，按2009 年FIGO 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，Ⅰ期24 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期7 例，Ⅳ期2 例;高分化(G1)22 例，中分化(G2)18 例，低分化(G3)10 例;肌層浸潤深度＜1/2 肌層31 例，≥1/2 肌層19 例;伴有淋巴轉(zhuǎn)移10例，無淋巴轉(zhuǎn)移40 例。另取同期因婦科疾病診刮或切除子宮的內(nèi)膜標(biāo)本:不典型增生的子宮內(nèi)膜50 例，正常增殖期子宮內(nèi)膜30 例。子宮內(nèi)膜癌患者年齡30 ～75 歲，平均年齡49.03 歲，95%CI(44.50，54.20)歲。所有病例術(shù)前均無放療、化療或雌、孕激素使用史，無手術(shù)禁忌，且臨床資料及病理資料完整。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 Maspin 一抗為兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，uPA 一抗為鼠抗人單克隆抗體(即用型)(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，SP 廣譜超敏試劑盒、PBS 緩沖液、DAB 酶底物顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 每例標(biāo)本經(jīng)常規(guī)甲酸固定，石蠟包埋，連續(xù)組織切片成4 μm 的切片，分別進(jìn)行HE 染色和免疫染色，以PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照，操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定 采用雙盲法觀察結(jié)果，高倍鏡下選擇10 個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其平均陽性百分率。Maspin、uPA 陽性為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色均勻顆粒，以胞漿為主，部分胞核表達(dá)。ER 陽性、PR 陽性均定位于細(xì)胞核，若同時(shí)可見胞漿著色的細(xì)胞，以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯棕黃-棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，而胞漿出現(xiàn)棕黃色為非特異性染色。根據(jù)著色強(qiáng)度和面積進(jìn)行綜合評(píng)分:(1)著色強(qiáng)度:0 分為無色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。(2)著色面積:0 分為無陽性細(xì)胞，1 分為陽性細(xì)胞≤10%，2 分為陽性細(xì)胞11% ～50%，3 分為陽性細(xì)胞51% ～75%，4 分為陽性細(xì)胞＞75%;染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積＜3 分為(－)，3 ～6 分為(+)，7 ～9 分為(+ +)，10 ～12 分為(+ + +);(－)和(+)為低表達(dá)，(+ +)和(+ + +)為高表達(dá)。見圖1 ～6。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 精確概率法，兩者相關(guān)性用非參數(shù)Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中Maspin、uPA、ER、PR 的陽性表達(dá)情況 ER 在正常增殖期子宮內(nèi)膜，不典型增生子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜癌中陽性表達(dá)率逐漸降低，分別為100%，72.00%，56.00%，PR 的表達(dá)情況與ER 呈一致性，分別為96.67%，70.00%，54.00%，Maspin 同樣表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢，分別為86.67%，52.00%，34.00%，而uPA 的表達(dá)情況卻相反，表現(xiàn)為逐漸升高趨勢，分別為13.33%，40.00%，54.00%，且組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

圖1 Maspin 蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(SP 法×200)

圖2 uPA 蛋白在低分化子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)(SP 法×400)

圖3 ER 蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(SP 法×200)

圖4 PR 蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(SP 法×200)

圖5 uPA 蛋白在高分化子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)(SP 法×200)

圖6 HE 染色對照片(×200)

表1 Maspin、uPA、ER、PR 蛋白在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá) %

2.2 Maspin、uPA、ER、PR 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系 Maspin 蛋白及uPA 蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)病理分期，肌層浸潤深度，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組3 種病理特征均有關(guān)，子宮內(nèi)膜癌的臨床分期越晚，肌層浸潤深度越深及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則二者的表達(dá)越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但在年齡組陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。而ER、PR 的表達(dá)與臨床-病理分期及組織學(xué)分化均有關(guān)，PR 與肌層浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P ＞0.05)。見表2。

2.3 Maspin、uPA、ER、PR 在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的相關(guān)性 Maspin 與uPA 呈負(fù)相關(guān)(r = －0.341，P ＜0.05);Maspin 和ER 呈 正 相 關(guān)(r = 0.287，P ＜0.05);Maspin 和PR 呈正相關(guān)(r =0.293，P ＜0.05);uPA和ER 呈負(fù)相關(guān)(r = －0.293，P ＜0.05);uPA 和PR呈負(fù)相關(guān)(r = －0.339，P ＜0.05);ER 和PR 呈正相關(guān)(r =0.302，P ＜0.05)。

表2 Maspin、uPA、ER、PR 與子宮內(nèi)膜癌臨床參數(shù)的關(guān)系 %

3 討論

3.1 Maspin 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義 Maspin是一種腫瘤抑制基因，其抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、抑制血管生成及與其他抑癌基因的聯(lián)合作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。諸多資料研究顯示，Maspin的表達(dá)缺失或低表達(dá)參與了人體多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如食管鱗癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞癌等［2］。本研究結(jié)果顯示:在子宮內(nèi)膜由正常增殖期內(nèi)膜到不典型增生再到子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程中，Maspin 陽性表達(dá)率逐漸降低(86.67%，52.00%，34.00%)，在Maspin 的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征間的關(guān)系上，研究發(fā)現(xiàn)臨床期別越早，組織分化越好，Maspin 表達(dá)越高;有淋巴轉(zhuǎn)移和肌層浸潤深度組中，Maspin 陽性表達(dá)率明顯降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道中Maspin 為抑癌基因一致，可能與Maspin 抑制腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的能力有關(guān)。方世蘭等［3］研究宮頸癌中Maspin 的表達(dá)與臨床分期，腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且隨訪發(fā)現(xiàn)Maspin 陰性組和陽性組生存狀態(tài)有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致，故可預(yù)測Maspin 可能參與了子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移、侵襲過程，其表達(dá)降低也暗示了子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后不良。

3.2 uPA 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義 uPA 是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，位于10 號(hào)染色體的長臂上，由10 個(gè)內(nèi)含子和11 個(gè)外顯子構(gòu)成，成熟的mRNA長度為2.4kb，由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等合成，與其受體(uPAR)結(jié)合后激活纖溶酶原，使之活化為纖溶酶，進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，也可以直接激活血管內(nèi)皮因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)和微血管基膜，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖及腫瘤血管生成創(chuàng)造了良好的微環(huán)境，即對細(xì)胞的遷移和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程有重要作用。據(jù)報(bào)道進(jìn)展期乳腺癌的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞uPAR mRNA 和蛋白水平的增加與惡性腫瘤如結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)［4－6］。本研究結(jié)果顯示:uPA 蛋白的陽性表達(dá)率隨著子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程逐漸升高(13.33%，40.00%，54.00%)，且子宮內(nèi)膜癌的惡性程度越高，臨床期別越晚，組織分化越差，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，uPA 的表達(dá)越高，可見uPA 是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤的重要因子，通過檢測uPA 的表達(dá)情況可用來判斷子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后，uPA 表達(dá)越高，患者的預(yù)后越差。

3.3 ER、PR 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義 對于ER、PR 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)意義，文獻(xiàn)中已有較多較深入的研究。臨床中ER、PR 的水平已經(jīng)作為子宮內(nèi)膜癌激素治療的主要指標(biāo)［7］。研究發(fā)現(xiàn)雌、孕激素受體的高表達(dá)可引起腫瘤組織自身內(nèi)分泌微環(huán)境的變化，啟動(dòng)雌、孕激素受體蛋白合成基因，合成具有結(jié)合活性的受體蛋白，從而獲得了依賴激素生長的特性［8－11］。即使在低激素水平刺激下也可導(dǎo)致腺體活性過度，從而促使子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生［12］，ER、PR 水平為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，其高表達(dá)與分化好、期別早及預(yù)后好相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示:ER 的陽性表達(dá)率(100%，72.00%，56.00%)與PR 陽性表達(dá)率(96.67%，70.00%，54.00%)基本一致。在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)較正常組織降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)臨床期別越晚，組織分化程度越低，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，癌癥浸潤深度越深，ER、PR 陽性表達(dá)率越低，證明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與ER、PR 的水平降低有關(guān)。

3.4 ER、PR、Maspin、uPA 之間的相關(guān)性 內(nèi)源性Maspin 是細(xì)胞uPA 的強(qiáng)抑制劑，通過與uPA 結(jié)合形成一種蛋白酶復(fù)合物，降低uPA 的釋放能力，減少纖溶酶原活化為纖溶酶，從而降低細(xì)胞的浸潤能力。本研究發(fā)現(xiàn):Maspin 和ER、PR 的表達(dá)呈一致性，Maspin 與uPA 呈負(fù)相關(guān)(r = －0.341，P ＜0.05)，uPA 和ER呈負(fù)相關(guān)(r = －0.293，P ＜0.05)，可推測ER、PR、Maspin 蛋白表達(dá)的下調(diào)可能在一定程度上導(dǎo)致uPA蛋白的表達(dá)上調(diào)，共同參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程。

綜述所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為ER、PR 及Maspin 均陽性而uPA 陰性的子宮內(nèi)膜癌患者臨床期別早，組織分化好，惡性程度低，其治療效果及預(yù)后相對較好，術(shù)后可考慮合并內(nèi)分泌治療，相反則提示腫瘤臨床期別晚，組織分化差，惡性程度高，術(shù)后需進(jìn)一步輔助治療及密切隨訪。但四者能否作為一個(gè)組合判斷子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后及指導(dǎo)治療，有待進(jìn)一步大樣本研究明確。

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