秦云霞等

農業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 海南儋州 571737）

摘 要 木霉菌具有抑制植物病原真菌生長的能力，因而成為開發(fā)土傳根部病害生防菌的首選之一。利用對峙培養(yǎng)法，測定8個木霉菌菌株對3個橡膠樹紅根病病原真菌的體外拮抗作用，并對篩選出來的木霉菌進行相互間的對峙培養(yǎng)分析。結果表明：有6個木霉菌對3個紅根病病原菌具有顯著拮抗效果；所選出的6個木霉菌之間盡管多數(shù)可以共存，但存在空間和營養(yǎng)競爭，尤其是棘孢木霉，很容易被其它木霉菌抑制和侵占，因此，在今后使用時不適宜混配。該實驗結果可為進一步篩選和利用生防菌防治橡膠樹根部病害提供理論依據(jù)。

關鍵詞 木霉菌 ；拮抗作用 ；橡膠樹紅根病 ；生物防治

分類號 S794.1 ；S476+.1

Abstract Trichoderma spp. has capacities of inhibiting or killing many pathogenic fungi， which make them one of the most promising bio-control agents of many soil-borne pathogens. In this study， the antagonistic effects of eight strains of Trichoderma on the soil-borne Ganoderma pseudoferreum， the pathogen of red root disease in Hevea brasiliensis， were tested with duel culture in vitro， as well as tested the mutual competitive effects among different Trichoderma strains selected. The results showed that six strains demonstrated markedly inhibiting effects and speciality to different pathogen strains. Obvious competition on nutrient and space were observed among the strains of Trichoderma spp.， especially the strong inhibition of the Trichoderma asperellum strain by other ones. Therefore， it is not recommended to mix them for synergistic bio-control function in future applications. These preliminary results will help further screening and utilization of the bio-control agents in the management of soil-borne pathogens of Hevea brasiliensis root diseases.

Keywords Trichoderma spp. ； antagonistic function ； Hevea brasiliensis Ganoderma pseudoferreum ； biocontrol

橡膠樹紅根病病原菌為Ganoderma pseudoferreum （Wakef.） Over.et steinm[1-2]，具有寄主多[3]、潛伏期長、在土壤中蔓延迅速[4]等特點。紅根病病原菌屬于真菌界擔子菌門，層菌綱，靈芝屬，它危害巴西橡膠樹根頸部，傳播速度很快[4]。紅根病菌主要依靠根系接觸傳染，也可通過風雨和昆蟲傳播[5]。橡膠樹紅根病在我國各植膠區(qū)內發(fā)生普遍，感染嚴重的林段發(fā)病率可達4.0%[4]，若沒有及時處理，死亡率可達100%[6]。橡膠樹根病的調查需要大量人力勞動，早期跟蹤調查工作不到位，普查效率低。而當橡膠樹地上部出現(xiàn)明顯的病癥時，已侵染發(fā)病嚴重，防治成本高且防效差。此病害的防治措施主要是采用化學防治和機械挖除[7-9]。2010年，尼日利亞N. O. Ogbebor等[10]開始篩選生防菌（包括木霉菌）用于防治橡膠樹紅根病，但至今還未見防治效果的報道，國內也未見利用木霉菌防治橡膠樹根病的報道。但是，近20年來，利用木霉菌進行根病防治的工作在多種經濟和糧食作物上迅速展開，例如楊樹[11]，水稻[12]，中草藥[13]，西瓜[14]等。因此，分離篩選具有拮抗橡膠樹紅根病的生防木霉菌，對橡膠樹根病綜合防控措施的合理制定具有指導作用，有利于橡膠樹種植業(yè)的持久、安全發(fā)展。

木霉菌（Trichoderma spp.）是一類重要的多功能益生真菌，廣泛存在于自然界中，資源豐富，種類眾多[15]，不僅能通過多種機制來控制病原菌的侵染和病害的發(fā)生，且還具有促進作物生長、提高作物抗生物和非生物脅迫的能力[16-19]，是一種公認的環(huán)境友好型真菌[20]。針對土傳病害具有潛伏期長、危害大的特點，近年來篩選優(yōu)良木霉菌用于防治土傳病害的工作進展很快[13，15，21]。

本文利用體外對峙實驗[22]，選用具有拮抗多種植物病原菌能力的8株多功能木霉菌株[23]，鑒定其是否具有拮抗橡膠樹紅根病病原菌的效果。研究結果可為創(chuàng)制防治橡膠樹根部病害的新型生物農藥奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹紅根病病原菌（G. pseudoferreum）菌株YN1、BT和DF采自不同橡膠種植區(qū)[24]，由本研究所種質資源課題組提供；PDA平板保存于4℃冰箱，并定期復蘇培養(yǎng)。所用的8個木霉菌分別為ACCC31639、ACCC31642、ACCC31657、ACCC31637、ACCC31757、ACCC30536（棘孢木霉Tri.asperellum）、HCS和DJ1。其中，HCS為商業(yè)化的哈茨木霉產品（美國拜沃-哈茨木霉菌根部專用型殺菌劑），棘孢木霉ACCC30536購自中國菌種網站（http：//www.mum800.com/），DJ1來自上海交通大學農業(yè)與生物學院，由陳捷教授惠贈；其余5個木霉菌均來自農業(yè)部微生物資源收集與保藏重點實驗室，由顧金剛教授惠贈，已證明這些菌株具有拮抗多種重要經濟作物病原菌的能力，如棉花黃萎病菌（Verticilium dahliae）、番茄灰霉病菌（B. cinerea）等[23]。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌、紅根病菌的復壯增殖培養(yǎng)

PDA培養(yǎng)基[24]，用于木霉菌和紅根病菌的復蘇培養(yǎng)以及木霉-病原菌對峙培養(yǎng)。

培養(yǎng)方法：在新鮮配置的PDA培養(yǎng)基上接種0.6 cm木霉菌和病原菌菌塊，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察和測量菌株的生長直徑，并記錄和拍照，等木霉菌長滿整個培養(yǎng)皿，紅根病菌菌體長至6 cm時，4℃低溫保存。

橡膠樹紅根病病菌的增殖培養(yǎng)方法：參照高秀兵等[25]對橡膠樹根病病原菌的培養(yǎng)方法，用曬干橡膠樹木屑 82%、麥麩15%、葡萄糖 2%、石膏粉 1%（質量百分比）， 加水混勻至濕潤，高溫滅菌后，放至室溫。在培養(yǎng)瓶中無菌接種病菌菌塊2～3個，并稍微壓實一下，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)。

1.2.2 對峙培養(yǎng)與抑菌率

在相同的PDA培養(yǎng)基上，與木霉菌生長速度相比，紅根病病菌（G. Pseudoferreum）在PDA培養(yǎng)基上生長較慢（日平均生長速度為0.5～1 cm），并且菌絲生長稀薄，很容易呈現(xiàn)老化形態(tài)。為了更準確鑒定木霉菌的拮抗效果，采用直徑0.6 cm的打孔器在新鮮配置的PDA培養(yǎng)基上打個孔，用滅菌后的小勺子把復壯培養(yǎng)好的紅根病菌填入到小孔中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等病菌直徑長至約4 cm時，再打另外一個孔接種木霉菌，二者間隔2～3 cm，每個菌株重復接種3次。在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定期觀察、記錄和拍照。定期測量紅根病病菌的生長直徑，同時測量沒接種木霉菌的紅根病病菌的生長情況（對照），計算抑制率。

抑菌率（%）=（對照組紅根病病菌的菌落半徑-處理組紅根病病菌的菌落半徑）×100/對照組紅根病病菌的菌落半徑。數(shù)據(jù)處理利用統(tǒng)計分析軟件DPS 7.5進行。

2 結果與分析

2.1 紅根病病菌的生長情況

選用橡膠木屑復壯培養(yǎng)病菌接種，紅根病病菌在PDA平板上菌絲體生長致密，呈現(xiàn)亮白色，具旺盛生長活力。表明利用橡膠木屑復壯培養(yǎng)的紅根病病菌生長良好，可以應用于后續(xù)的生防菌拮抗對峙實驗。見圖1。

2.2 8個木霉菌株的形態(tài)特征

根據(jù)木霉菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長與產孢特性，HCS、DJ1、ACCC31757和ACCC31657屬于產孢型菌株，而其余4株屬于產絲型菌株，其不同的生長特征見表1和圖2。

2.3 對峙分析

對峙培養(yǎng)實驗結果表明，除了ACCC31637 和DJ1外，其余6個木霉菌都對3株紅根病菌均有顯著的拮抗效果，能夠在15 d內抑制、侵占、甚至殺死紅根病病菌菌絲體。這6個木霉菌對3種橡膠樹紅根病菌的拮抗能力大小有一定差異，且整體上產絲型木霉菌比產孢型木霉菌抑制病菌生長的能力更強（圖3，表2）。

從與DF對峙培養(yǎng)拮抗效果看，6個木霉菌的拮抗能力高低順序為：HCS>ACCC31657>ACCC30536>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31757；從與BT對峙培養(yǎng)拮抗效果看，其拮抗能力順序為HCS>ACCC31757>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31657>ACCC30536；與YN1的拮抗能力順序為HCS>ACCC31757>ACCC30536>ACCC31657>ACCC31642>ACCC31639。

從8個木霉菌與橡膠樹紅根病菌的對峙動態(tài)分析中得知，經過10 d的對峙培養(yǎng)，對3種紅根病菌的抑制率最低的是ACCC31637和DJ1，其余6個木霉菌對紅根病菌YN1的抑制率差異較大，為39%～100%，對BT和DF的抑制率差異小，分別為58.84%～100%和60%～100%。其中HCS、ACCC31757、ACCC31639、ACCC31642和ACCC31657 這5個木霉菌對紅根病BT株系的抑制率能達到100%；HCS和ACCC31757兩個木霉菌對紅根病YN1株系的抑制為100%；HCS和ACCC31657兩個木霉菌對紅根病DF株系的抑制率達100%。

2.4 木霉菌混配共生能力分析

木霉菌頑強的競爭生存能力是其拮抗能力的重要組成部分，在前期實驗的基礎上，選擇對3種紅根病菌拮抗能力強的ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536這四個木霉菌，分析其是否存在共生或抑制作用。在同一個平板上同時接種4個不同組合的木霉菌株（ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536），培養(yǎng)4 d后，觀察和拍照。結果發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌株ACCC30536的生存空間被其它3個木霉菌株侵占。其中，ACCC31639的競爭能力很強，共培養(yǎng)4 d可以逐漸侵占HCS的生長空間。盡管這些木霉菌之間一定程度上可共存，但相互間主要產生抑制，因此混合施用不同木霉菌來協(xié)同拮抗紅根病菌的做法效果可能不佳。見圖4。

3 討論與結論

本實驗結果表明，所選用的8個木霉菌中，有6個木霉菌對3株橡膠樹紅根病病菌表現(xiàn)出很強的體外拮抗能力，但不同木霉菌之間存在拮抗作用，所以，在今后的生產應用中，不同木霉菌株不宜混配，應主要考慮木霉菌與肥料、殺菌劑等其他成分的混配。據(jù)報道，海南橡膠樹紅根病病菌的性狀差異達到變種級水平，被分為類型Ⅰ和類型Ⅱ兩個不同變種[26]。但本實驗結果表明6個木霉菌對3個紅根病病原菌的拮抗能力差異不大，間接表明所檢測的3個病原菌有可能屬于同一個變種類型，因此，本文結果不能反映測試木霉菌菌株對橡膠樹紅根病病菌的綜合拮抗能力。在后續(xù)工作中，需要采集來源更廣泛的橡膠樹紅根病病菌菌株進行測定，以期科學評估木霉菌菌株的體外拮抗能力與應用前景。

體外對峙實驗盡管是生防菌篩選的重要手段，但往往僅是篩選工作的第一步，生防菌田間施用后會受到土壤環(huán)境（特別是土著微生物）、根際定植、天氣和人為干預等眾多因素的影響。今后還需要在深入了解其生物學特征的基礎上，采用多種篩選方法繼續(xù)評估木霉菌的實際應用效果[27]。例如檢測木霉菌在橡膠苗根際的定植能力、促生效果和大田應用中對其他主要橡膠樹根病病原菌的拮抗實效等。同時，還需加強篩選在橡膠樹根際定殖的本地木霉菌株或其內生木霉菌株，它們可能會具有更好的區(qū)域適應性，深入了解木霉菌對橡膠根病病菌的拮抗機制，進行木霉菌的誘導突變、菌株篩選與改良等。

致 謝 對上海交通大學農業(yè)與生物學院陳捷教授技術指導，中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所的顧金剛博士為本實驗提供實驗菌株，并提出寶貴建議，在此一并致謝！

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