柯金龍，彭 慧，劉 冰，鄧 旭，邢 鋒

1)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060; 2)深圳大學(xué)土木工程學(xué)院，深圳518060

【生物工程 / Bioengineering】

混凝土修復(fù)功能菌BacilluscohniiDSM6307芽孢發(fā)酵條件優(yōu)化

柯金龍1，彭 慧1，劉 冰1，鄧 旭1，邢 鋒2

1)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060; 2)深圳大學(xué)土木工程學(xué)院，深圳518060

對嗜堿科式芽孢桿菌(alkaliphilicBacilluscohnii, DSM6307)芽孢形成的影響因素進行了研究.單因素實驗結(jié)果表明，蔗糖為最適碳源，最佳質(zhì)量濃度為1.0 g/L；牛肉膏為最適氮源，最佳質(zhì)量濃度為3.0 g/L；Mn2+最適質(zhì)量濃度為3.2 mg/L；Mg2+最適質(zhì)量濃度為0.12 g/L；最適溫度為30 ℃；裝液量為50 mL (250 mL錐形瓶)．運用Plackett-Burman法研究了碳源、氮源、微量元素、溫度和裝液量5個因素對DSM6307產(chǎn)芽孢數(shù)的影響，結(jié)果表明，碳源、氮源和Mn2+是影響DSM6307芽孢產(chǎn)量的顯著因子.運用中心組合設(shè)計實驗對這3種顯著因子進行優(yōu)化后，應(yīng)用響應(yīng)面模型測出蔗糖、牛肉膏和Mn2+的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為1.30 g/L、3.29 g/L和11.48 mg/L，預(yù)測芽孢數(shù)為1.67×109mL-1.在此優(yōu)化條件下，實驗得到的芽孢數(shù)為1.50×109mL-1，與預(yù)測值接近.

礦化微生物；嗜堿芽孢桿菌；芽孢形成；優(yōu)化條件; Plackett-Burman設(shè)計；中心組合設(shè)計

混凝土裂縫的微生物修復(fù)是一種新型修復(fù)技術(shù)，其機理是利用自然界普遍存在的礦化微生物的新陳代謝，生成一些以碳酸鈣為代表的相對不溶或難溶的化合物，對修復(fù)混凝土材料進行修復(fù).目前，荷蘭Delft大學(xué)[1]和比利時Ghent大學(xué)[2-3]基于微生物礦化的機理，在微生物自修復(fù)方面均取得較好的進展.由于微生物的營養(yǎng)細胞不能耐受混凝土攪拌時的高速剪切力，并難以度過混凝土的水化期，因此，將微生物用于混凝土內(nèi)部裂縫自修復(fù)時不能直接以營養(yǎng)細胞的形式預(yù)埋.為此，Jonkers等[4]開創(chuàng)性地選擇以細菌芽孢的形式埋入混凝土.與營養(yǎng)細胞相比，芽孢因其特殊的生理結(jié)構(gòu)與功能更能承受混凝土成型攪拌時的高速沖擊力以及內(nèi)部的強堿環(huán)境，且水化后的混凝土內(nèi)部是一個相對干燥的封閉環(huán)境，休眠狀態(tài)的芽孢可長期存活其中.當混凝土裂縫出現(xiàn)時，進入裂縫的水分和空氣觸發(fā)休眠芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞，營養(yǎng)細胞通過新陳代謝作用并利用混凝土富含的鈣源生成碳酸鈣以修復(fù)裂縫.當裂縫修復(fù)完畢后，又在內(nèi)部產(chǎn)生新的芽孢休眠體，等待下一次修復(fù)的啟動.Jonkers等[5]的研究表明，芽孢預(yù)埋數(shù)量為1.14×109mL-1時，基本不會影響混凝土的抗拉和抗壓能力.考慮到混凝土的高強堿性環(huán)境，用于混凝土自修復(fù)的微生物多為嗜堿性芽孢桿菌[6].目前國內(nèi)外對巴氏芽孢桿菌[7]和巴士芽孢八疊球菌的研究較多[8].

為滿足工業(yè)化應(yīng)用，必須優(yōu)化用于混凝土裂縫修復(fù)的微生物芽孢發(fā)酵的條件，大幅提高芽孢產(chǎn)量.影響芽孢產(chǎn)量的因素眾多，因此，采用科學(xué)合理的實驗方法對各因素進行優(yōu)化十分必要.以往對芽孢方面的研究主要集中在畜牧、水產(chǎn)、醫(yī)藥、保健和食品等行業(yè)，研究內(nèi)容也基本以休眠芽孢在特定條件下的復(fù)蘇為主，如何有效提高芽孢生成產(chǎn)率鮮有涉及.本研究通過單因素優(yōu)化試驗考察了碳源、氮源、微量元素、裝液量和溫度對科氏芽孢桿菌芽孢形成的影響，并進一步采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計法[9]和響應(yīng)面優(yōu)化分析法求得最佳的芽孢發(fā)酵條件，獲取最大產(chǎn)量的芽孢，為后期芽孢參與混凝土裂縫修復(fù)奠定實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌 種

嗜堿科氏芽孢桿菌(alkaliphilicBacilluscohnii, DSM6307)，由荷蘭代爾夫特理工大學(xué)提供.

1.1.2 種子培養(yǎng)基(1 L)

5.000 g牛肉膏、3.000 g蛋白胨、0.530 g Na2CO3和0.420 g NaHCO3.

1.1.3 初始芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)

0.020 g 磷酸二氫鉀、0.225 g 二水氯化鈣、0.200 g 氯化鉀、0.200 g 六水氯化鎂、0.010 g 一水硫酸錳、1.000 g 酵母粉、0.375 g 硝酸鉀、0.200 g 氯化銨、10 mmol/L 乳酸鈉(單獨滅菌)和5.300 g 碳酸鈉/4.200 g 碳酸氫鈉(單獨滅菌).

1.1.4 單因素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)

根據(jù)試驗需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加碳源、N源配制優(yōu)化培養(yǎng)基.基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 0.020 g 磷酸二氫鉀、0.225 g 二水氯化鈣、0.200 g 氯化鉀、 0.200 g 六水氯化鎂、 0.010 g一水硫酸錳、 5.300 g碳酸鈉/4.200 g 碳酸氫鈉.

碳源優(yōu)化培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為1.0 g/L的不同碳源，如蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘露糖和葡萄糖，然后再添加1.000 g 酵母粉、0.375 g 硝酸鉀和0.200 g 氯化銨，配制成5種不同碳源種類的優(yōu)化培養(yǎng)基；獲得最佳碳源后，基于碳源培養(yǎng)基，配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、4.0、7.0、10.0、13.0、16.0和20.0 g/L的碳源優(yōu)化培養(yǎng)基.

氮源優(yōu)化培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為3.0 g/L的不同氮源，如牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硝酸銨、尿素和硝酸鈉，再添加10.0 mmol/L的乳酸鈉，配制氮源種類優(yōu)化培養(yǎng)基；獲得最佳氮源后，基于氮源培養(yǎng)基，配制成8種質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 g/L的氮源優(yōu)化培養(yǎng)基.

微量元素優(yōu)化培養(yǎng)基：以初始芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過改變MgCl2·6H2O的質(zhì)量濃度，配制出Mg2+質(zhì)量濃度分別為0.06、0.12、0.24和0.36 g/L的Mg2+優(yōu)化培養(yǎng)基；通過改變MnSO4·H2O的濃度，配制出Mn2+質(zhì)量濃度分別為1.6、3.2、6.5、9.8、13.0和16.0 mg/L的Mn2+優(yōu)化培養(yǎng)基.

1.2 實驗方法

1.2.1 活化和種子培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出菌種，按0.1%(體積分數(shù))接種至30 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃ 150 r/min 培養(yǎng)24 h后，接入100 mL種子培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，以備后用.

1.2.2 單因素優(yōu)化芽孢發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按1%(體積分數(shù))接種至碳源、氮源和微量元素優(yōu)化培養(yǎng)基中，裝液量和溫度的優(yōu)化使用初始芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶分裝50 mL，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)4 d后，利用細菌計數(shù)板計數(shù)[10].

1.2.3 Plackett-Burman設(shè)計

根據(jù)DSM6307芽孢形成條件，通過單因素實驗探究，選取11個因素，每個因素分為兩個水平類，因素低水平用“-1”表示，因素高水平用“1”表示(表1).

表1 Plackett-Burman設(shè)計

1.2.4 中心組合設(shè)計

依據(jù)單因素實驗、PB設(shè)計所確定的顯著影響因素及最佳的取值范圍，進行中心組合設(shè)計實驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對DSM63076307芽孢形成的影響

2.1.1 碳 源

在培養(yǎng)基成分中，碳源及其濃度是影響芽孢形成的主要因素[11].考察5種不同碳源的影響，結(jié)果如圖1(a). 由圖1(a)可見，DSM6307對各種碳源均可以利用，以蔗糖為碳源時芽孢的產(chǎn)量最高，比對照組(以乳酸鈉為碳源)芽孢數(shù)高55.47%.但以甘露醇和葡萄糖為碳源時，芽孢產(chǎn)量較低.從成本及效果等方面考慮，選取蔗糖為最佳碳源.

圖1(b)是不同蔗糖質(zhì)量濃度下芽孢的生成情況.以1.0 g/L的蔗糖為碳源時，其產(chǎn)芽孢數(shù)最高，達1.24×109mL-1.總體來看，低質(zhì)量濃度的蔗糖(0.5和1.0 g/L)更利于芽孢的生成，這可能是由于高質(zhì)量濃度導(dǎo)致營養(yǎng)條件更為優(yōu)越，使得已形成的芽孢進一步萌發(fā).

圖1 碳源和蔗糖質(zhì)量濃度對DSM6307芽孢形成的影響Fig.1 Influences of carbon source and sucrose concentration on the DSM6307 spore formation

2.1.2 氮 源

培養(yǎng)基中的氮源也影響芽孢的形成[11].圖2(a)的結(jié)果表明，以牛肉膏為氮源時產(chǎn)芽孢數(shù)最高，達1.55×109mL-1，比對照組(酵母粉為氮源)高85.77%；以蛋白胨為氮源時，產(chǎn)芽孢數(shù)達1.20×109mL-1，較對照組增加了81.68%；以氯化銨和硝酸銨為氮源時，產(chǎn)芽孢數(shù)較對照組分別增加了70.55%和57.75%；而以硝酸鈉和尿素為氮源時，芽孢產(chǎn)量與對照組基本持平.t檢驗也證明以硝酸鈉和尿素為氮源與對照組無明顯區(qū)別.顯然，與無機氮源相比，有機氮源更有利于芽孢的形成.綜合各方面考慮，確定牛肉膏為最佳氮源.此結(jié)果與文獻[12]的部分研究結(jié)果相近.

圖2 氮源和牛肉膏質(zhì)量濃度對DSM6307芽孢形成的影響Fig.2 Influences of nitrogen source and beef extract concentration on the DSM6307 spore formation

與碳源不同，高質(zhì)量濃度的氮源似乎更利于芽孢形成.從圖2(b)來看，DSM6307芽孢數(shù)隨牛肉膏質(zhì)量濃度的增加基本呈上升趨勢，當?shù)促|(zhì)量濃度為3.0g/L時，芽孢產(chǎn)量最高，達1.67×109mL-1.隨著牛肉膏質(zhì)量濃度進一步增加，芽孢數(shù)量卻出現(xiàn)下降.

碳和氮源都是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，但兩者質(zhì)量濃度對芽孢的影響差異較大，可能是因為碳源一般是作為細胞生長的能量物質(zhì)，在芽孢沒有萌發(fā)前需求不大；而氮源的主要功能是為細胞合成包括DNA在內(nèi)的各種成分提供骨架，這對于芽孢的形成是必不可少的.

2.1.3 微量元素

圖3 ρ(Mn2+)和ρ(Mg2+)對DSM6307芽孢形成的影響Fig.3 Influences of manganese ion and magnesium ion on the DSM6307 spore formation

作為細胞生長必需的微量元素，Mg2+和Mn2+對營養(yǎng)體的生長和芽孢的形成影響都較大，但不同種類微生物表現(xiàn)結(jié)果各不相同[13].圖3實驗結(jié)果表明，隨著質(zhì)量濃度的變化，兩種離子對芽孢生成的影響均呈先升后降趨勢，且都存在最佳質(zhì)量濃度，ρ(Mg2+)=0.12 g/L時，芽孢數(shù)為7.20×108mL-1；ρ(Mn2+)=3.2 mg/L時，芽孢數(shù)最多，為5.20×108mL-1.

一般認為，Mg2+作為己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氧酶的活性中心組分，有利于細胞營養(yǎng)體生長，但不利于芽孢的形成.重金屬元素Mn2+可能會對微生物有毒害作用，從而觸發(fā)營養(yǎng)細胞的應(yīng)激機制導(dǎo)致芽孢的形成.已有研究表明，芽孢數(shù)會隨ρ(Mn2+) 增加而增加，在某一質(zhì)量濃度時，芽孢數(shù)達到峰值，隨后下降[14]，這與本研究結(jié)果一致.

2.1.4 裝液量

DSM6307是一株好氧菌，生長過程需要氧的攝入.在轉(zhuǎn)速相同時，裝液量多少反映培養(yǎng)液中溶氧水平的高低.圖4結(jié)果表明，隨著裝液量的增加，芽孢數(shù)呈下降趨勢.250 mL錐形瓶的裝液量為1/5(50 mL)時，芽孢數(shù)最高，為5.20×108mL-1.當裝液量為4/5(200 mL)時，芽孢數(shù)急劇下降，說明足夠的溶氧對芽孢形成十分重要.

圖4 裝液量對DSM6307芽孢形成的影響Fig.4 Influence of the loading volume on the DSM6307 spore formation

2.1.5 溫 度

圖5 溫度對DSM6307芽孢形成的影響Fig.5 Influence of the temperature on DSM6307 spore formation

溫度對芽孢形成也有影響[13].DSM6307在生長范圍內(nèi)芽孢數(shù)隨溫度升高呈先升后降趨勢.從20 ℃上升至30 ℃時，芽孢數(shù)達到最大值，為5.72×108mL-1；上升到50 ℃時，芽孢數(shù)急劇下降，顯微鏡下觀察幾乎沒有芽孢，營養(yǎng)體數(shù)目也極少.過高的溫度使得營養(yǎng)體難以存活，直接扼殺了芽孢在營養(yǎng)體內(nèi)的形成.

2.2 PB實驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過PB設(shè)計法對各影響因素進行比較，以找出影響芽孢形成的關(guān)鍵因素(表2).

表2 PB法實驗結(jié)果1)

1)-表示無意義

表2顯示，實驗設(shè)計P=0.006 8<0.05時，該設(shè)計有意義.ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)的P值分別為0.010 9、0.014 8和0.017 8，均小于0.05，說明這3個因素影響顯著，相比之下，其他因素為非顯著影響因素；R2=0.783 3，表明該模型能夠解釋78.33%的實驗結(jié)果，結(jié)果可靠. 因此，ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)為影響DSM6307芽孢形成的關(guān)鍵因子，可進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化.

2.3 中心組合設(shè)計

針對PB實驗得出的3個關(guān)鍵影響因素，利用中心組合設(shè)計法(表3)進一步分析，結(jié)果見表4.

表3 中心組合設(shè)計

由表4可知，失擬值的F=3.71，P>0.05，差異不顯著；總模型的F=244.67，R2=0.995 5，P<0.001，達到非常顯著水平，表明該模型能較好地進行模擬預(yù)測.表4中各項指標的P值均小于0.05，說明3個關(guān)鍵因素對芽孢形成的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義.

表4 中心組合設(shè)計方差分析結(jié)果1)

1)-表示無意義

不同因素之間的相互作用對芽孢產(chǎn)率的影響可用等高線表示.等高線的形狀顯示兩種因素之間相互作用的強弱，等高線為圓形說明這兩種因素之間相互作用不顯著，橢圓形則表明這兩種因素之間具有較強的相互作用.圖6的等高線都呈橢圓形，說明ρ(蔗糖)與ρ(牛肉膏)、ρ(蔗糖)與ρ(Mn2+)以及ρ(牛肉膏)與ρ(Mn2+)間的相互作用都較強，但ρ(牛肉膏)與ρ(Mn2+)之間的相互作用較其他兩種因素相對較弱.

通過中心組合設(shè)計實驗可擬合出芽孢數(shù)與3種關(guān)鍵因素之間的模型方程：

Y=1.172×109+2.729×107P1-3.635× 107P2-5.545×107P5-4.587× 107P1P2+4.588×107P1P5-1.962× 107P2P5-4.401×107P12-1.442× 108P22-1.603×108P52

(1)

其中，Y為預(yù)測芽孢數(shù)；P1、P2和P5分別為ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)作用后產(chǎn)芽孢數(shù).

由式(1)預(yù)測出各因素最優(yōu)的組合為：ρ(蔗糖)=1.30g/L、ρ(牛肉膏)=3.29g/L、ρ(Mn2+)=11.48mg/L，該條件下預(yù)測芽孢數(shù)為1.67×109mL-1.在CCD-RSM求得的最佳條件下，對DSM6307進行產(chǎn)芽孢發(fā)酵實驗，結(jié)果為1.50×109mL-1，與預(yù)測值相差10.18%，具有可信度.

圖6 影響因子對芽孢形成影響的等高線Fig.6 (Color online) Contours of the influence factors on DSM6307 spore formation

結(jié) 語

本研究對用于混凝土裂縫自修復(fù)的嗜堿芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的影響因素進行了系統(tǒng)地考察.通過單因素法分析了碳源、氮源、微量元素、溫度和裝液量等因素的影響，利用Plackett-Burman法從上述影響因素中篩選出ρ(蔗糖)、ρ(牛肉膏)和ρ(Mn2+)為3個影響DSM6307芽孢形成的顯著因子，經(jīng)中心組合設(shè)計實驗及響應(yīng)面模型得出蔗糖、牛肉膏和Mn2+的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為1.30g/L、3.29g/L和11.48mg/L，預(yù)測芽孢數(shù)為1.67×109mL-1.實驗得到的芽孢數(shù)為1.50×109mL-1，高于單因素優(yōu)化結(jié)果，提高了芽孢產(chǎn)量. 今后將從以下方面開展深入研究：① 利用平板菌落計數(shù)法研究芽孢存活率；② 尋找芽孢產(chǎn)率更高的菌株；③對如何提高芽孢預(yù)埋混凝土后的活性進行探究.

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【中文責編：晨 兮；英文責編：艾 琳】

Optimization of spore production condition of concrete self-healing bacteriumBacilluscohniiDSM6307

Ke Jinlong1, Peng Hui1, Liu Bing1, Deng Xu1?, and Xing Feng2?

1) College of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China 2) College of Civil Engineering , Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

This paper investigates the influential factors of the spore production of alkaliphilicBacilluscohnii(DSM6307).Firstly,weemployedasinglefactoroptimizationmethodandobtainedtheresultsthattheoptimumcarbonsourceissucrosewiththesuitableconcentrationof1.0g/L;theoptimumnitrogensourceisabeefextractwithasuitableconcentrationof3.0g/L;theoptimalconcentrationofMn2+is3.2mg/L,andtheoptimalconcentrationofMg2+is0.12g/L;thesuitabletemperatureis30 ℃,andtheloadingvolumeis50mLina250mLconicalflask.ThenthePlackett-Burmandesignoftheexperimentrevealsthatthecarbonsource,nitrogensourceandMn2+arethesignificantfactorsamongthe5factorsofcarbonsource,nitrogensource,microelementlevel,temperatureandtheloadingvolume.Finally,weperformedfurtheroptimizationwithcentralcompositedesignandresponsesurfaceanalysis,anditisfoundthatthesporeproductionofDSM6307is1.67×109mL-1withoptimizedconcentrationsofsucrose,beefextractandMn2+being1.30g/L, 3.29g/Land11.48mg/L,respectively.Undersuchoptimizedconditions,theactualsporeproductioninourexperimentis1.50×109mL-1andisclosetothepredictedone.

mineralized microbes; alkaliphilicBacillussp.; spore forming; condition optimization; Plackett-Burman design；central composite design

：Ke Jinlong, Peng Hui, Liu Bing, et al. Optimization of spore production condition of concrete self-healing bacteriumBacilluscohniiDSM6307[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2015, 32(2): 145-151.(in Chinese)

X 524

A

10.3724/SP.J.1249.2015.02145

國家自然科學(xué)基金委國際(地區(qū))合作與交流項目(51120185002)

柯金龍(1989—),男(漢族), 安徽省安慶市人，深圳大學(xué)碩士研究生.E.mail：565401695@qq.com

Received：2014-09-24；Accepted：2014-12-06

Foundation：Funds for International Cooperation and Exchange of the National Natural Science Foundation of China(51120185002)? Corresponding author：Professor Deng Xu, E-mail:dengxu@szu.edu.cn; Professor Xing Feng, E-mail: xingf@szu.edu.cn

引 文：柯金龍，彭 慧，劉 冰，等. 混凝土修復(fù)功能菌BacilluscohniiDSM6307芽孢發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報理工版，2015，32(2)：145-151.