楊紅梅,曹 蕾,單麗芳,宋 英,涂 翔,鐘 森

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072)

?

不同方法提取雙黃二仙水提液中黃芪甲苷實(shí)驗(yàn)研究

楊紅梅1,曹 蕾1,單麗芳1,宋 英2*,涂 翔2,鐘 森2

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072)

目的：比較不同提取方法對雙黃二仙顆粒水提液黃芪甲苷提取效果的影響,建立雙黃二仙藥液中黃芪甲苷含量測定方法。方法：分別采用超聲法、大孔樹脂法和水飽和正丁醇-氨試液萃取法提取藥液中黃芪甲苷，使用HPLC-ELSD法測定其含量。結(jié)果：測定了3種提取方法下的黃芪甲苷的含量,建立了以水飽和正丁醇-氨試液的提取為該制劑提取黃芪甲苷的含量測方法。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好,專屬性強(qiáng),為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

黃芪甲苷;提取工藝;含量測定

雙黃二仙顆粒是由黃芪、沙苑子等 7 味藥材經(jīng)提取、濃縮、加工而制成的制劑，具有益氣攝精、補(bǔ)腎降蛋白的功效。黃芪為方中要藥，其所含的成分主要為黃芪甲苷等皂苷類成分及毛蕊異黃酮等黃酮類成分[1]，且黃芪甲苷等皂苷為本方的主要藥效成分，為了更好地控制雙黃二仙顆粒的質(zhì)量,需對方中君藥黃芪進(jìn)行定量檢測。黃芪甲苷含量高、性質(zhì)穩(wěn)定，故以黃芪甲苷作為該制劑的指標(biāo)。本研究采用HPLC-ELSD法對雙黃二仙顆粒中黃芪甲苷的含量進(jìn)行測定[2]。

1 材料

1.1 儀器

電子天平(十萬分之一)BP-211D 賽多利斯科學(xué)儀器(中國)有限公司；HZT-A+200型電子天平福州華志科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀HP-1260惠普公司。

1.2 試劑試藥

黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院),純度為95.8%，批號:110781-201314。黃芪飲片(生產(chǎn)批號：1411015)，四川新荷花中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液中黃芪甲苷的提取

精密吸取本品藥液25mL，加水稀釋至50mL，用60mL水飽和的正丁醇振搖提取4次，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌正丁醇液2次，每次60mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水10mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5cm，柱高為12cm)，以水50mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

精密吸取本品藥液25mL，加水稀釋至50mL，用水飽和正丁醇提4次，每次60mL，合并正丁醇液，氨試液洗2次，每次60mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

精密吸取本品藥液25mL，加水稀釋至50mL,加氨試液10mL,振搖充分,再加入正丁醇60mL,密塞,超聲處理(功率600W,33kHz)15min,靜置分層,傾出上層正丁醇液,下層再加入正丁醇60mL,同法再處理1次,合并2次正丁醇液,濾過,濾液用水洗滌2次,每次60mL,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[3]。

精密吸取本品藥液25mL，加水稀釋至50mL,加入正丁醇60mL,密塞,超聲處理(功率600W,33kHz)15min,靜置分層,傾出上層正丁醇液,下層再加入正丁醇60mL,同法再處理1次,合并2次正丁醇液,濾過,濾液用水洗滌2次,每次60mL,棄去水液,再用氨試液10mL洗滌，正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品4.27mg，置25mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(0.170 8mg/mL)。

2.3 供試品溶液制備

精密量取上述樣品溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液作為供試品溶液。

3 樣品含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱：菲羅門Phenomenex ODS(5μm，4.6mm×150mm)；流動相：以A∶B(35∶65)為流動相 [A為乙腈；B為高純水]；流速：0.8mL/min；柱溫：25℃；檢測器：蒸發(fā)光檢測器[4]。

3.2 專屬性考察

以處方比例，取缺黃芪藥材的其他飲片，按本制劑制備工藝制得缺黃芪陰性藥液。按“3.1”項HPLC-ELSD條件進(jìn)行試驗(yàn),比較陰性溶液、對照溶液與供試品溶液的HPLC-ELSD圖譜，如圖1所示。

圖1 黃芪陰性樣品和對照品、供試品溶液的液相色譜

結(jié)果顯示，在黃芪甲苷峰位處無吸收，空白無干擾,樣品和黃芪甲苷對照品在相應(yīng)的主峰位置上有相應(yīng)的色譜峰,且分離度較好。

3.3 線性關(guān)系考察

精密稱取黃芪甲苷對照品3.76mg，置20mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。另精密吸取上述對照品2、6、8、10、12μL按“3.1”項下方法使用蒸發(fā)光測定，以進(jìn)樣量對數(shù)(lgx)為橫坐標(biāo)，以峰面積對數(shù)(lgy)為縱坐標(biāo)，得回歸方程:y=1.774 5x+3.062 2，r=0.999 8。結(jié)果顯示，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.376 5～2.259 0μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 含量測定

精密吸取上述3種供試品溶液，按“3.1”項下方法，對照品分別進(jìn)樣2μL、10μL，樣品進(jìn)樣10μL，測得各自峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計算黃芪甲苷的含量，如表3所示。

表3 提取方法的篩選 (n=3)

結(jié)果：提取方法1所測定的含量較方法2、3高，但方法1的提取過于繁瑣復(fù)雜，不利于操作，方法2簡便且測得含量較高，適宜實(shí)際操作，故將方法2作為本制劑的提取方法。

3.5 精密度考察

取本品10mL,按“2.1”項下方法，在同一實(shí)驗(yàn)室，考察儀器的精密度，進(jìn)樣 10μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得峰面積，計算含量。測得RSD值為1.59%，結(jié)果顯示，精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性考察

取本品10mL，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于放置后的 0、2、4、8h使用蒸發(fā)光測定，進(jìn)樣10μL。結(jié)果顯示RSD值為1.97%，本品供試品溶液在8h內(nèi)檢測穩(wěn)定性較好，該方法穩(wěn)定可行。

3.7 重復(fù)性

取本品10mL，稱取6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定。結(jié)果顯示藥液中黃芪甲苷含量平均值為0.031 4mg/mL，RSD值為1.97%，本方法的重復(fù)性較好。

3.8 加樣回收

精密稱量黃芪甲苷對照品3.15mg，置20mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(0.157 5mg/mL)。取已知含量的樣品藥液5mL(0.031 5mg/mL)，共6份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液(0.157 5mg/mL)1mL，按供試品方法制備樣品。按照上述色譜條件，精密吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算黃芪甲苷的含量。計算回收率：黃芪甲苷的平均回收率為101.03%，回收率在95%～105%，RSD=0.94%,表明該方法的加樣回收率較好，該方法的準(zhǔn)確度較好。

4 討論

考查不同的流動相對本品的影響。按照2010版藥典，測黃芪甲苷的流動相為乙腈-水(32∶68) ，保留時間約15.5min，基線較平，但連用蒸發(fā)光散射檢測器時，對照品峰面積波動非常大，不適合用來計算樣品含量，故將流動相調(diào)至乙腈-水(35∶65)，效果良好， 同時考查漂移管溫度、載氣流速對本品的影響。結(jié)果顯示，漂移管溫度為102℃ 時，基線較好，峰分離好; 載氣流速為2.6mL/min時，峰狀態(tài)較好。

[1] 朱燕輝，嚴(yán)豐祥.黃芪甲苷及其生物學(xué)活性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8(4):781-783.

[2] 彭全材,胡繼偉,楊占南，等.HPLC測定貴州產(chǎn)黃芪中黃芪甲苷的含量[J].江西師范大學(xué)學(xué)報，2007,31(7)：278-281.

[3] 胡琨.HPLC測定芪腎口服液中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,30(2):195-196.

[4] 雷健，胡雪蓮，金一南，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定益生膠囊中黃芪甲苷含量[J].中國藥業(yè)，2011,21(16):47-48.

(責(zé)任編輯：余 婷)

Study on different extraction methods of Shuanghuang Erxian aqueous extract of Astragaloside

Yang Hongmei1,Cao Lei1,Shan Lifang1,Song Ying2*,Xu Xiang2,Zhong Sen2

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine(TCM) ,Chengdu 610075, China; 2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To compare the effect of different extraction methods on the extraction of Radix astragalus of Shuanghuang Erxian aqueous extract.To establish a method for determination the astragaloside of Shuanghuang Erxian liquid.Methods:Using ultrasonic method,macroporous resin method and water saturated butanol-ammonia solution extraction liquid of Astragaloside,HPLC-ELSD method was used to determine its content.Results:Determination the content of Astragalus with three extraction methods,A method for the extract of Astragalus by water saturated butanol was established.Conclusion:The method is accurate,sensitive,reproducible and specific,which lays the foundation for the formulation of the quality standard of the preparation.

Astragalus;Extraction;Content Determination

2015-08-05

四川省中醫(yī)藥管理局青年基金(2014K108)；成都市科技局科技惠民應(yīng)用示范項目(2014-HM02-00014-SF)；成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科技發(fā)展基金(2013-D-YY-14)

楊紅梅(1989-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。

宋英(1959-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail：806380106@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)23-0035-02

10.11954/ytctyy.201523013