周 陽(yáng)，雷 荃，郭 巧，劉勇慧，王欣偉，湯依群

(中國(guó)藥科大學(xué) 臨床藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

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TRPM7參與誘發(fā)心肌纖維化作用及藥物干預(yù)

周 陽(yáng)，雷 荃，郭 巧，劉勇慧，王欣偉，湯依群*

(中國(guó)藥科大學(xué) 臨床藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

目的：研究脂多糖(LPS)引起的成纖維細(xì)胞上TRPM7通道的上調(diào)和細(xì)胞增殖間的關(guān)系，并利用黃芪甲苷進(jìn)行干預(yù)。方法：分離大鼠乳鼠心臟成纖維細(xì)胞，分成7組，正常組、模型組(LPS 0.1μg·mL-1、1μg·mL-1)、TRPM7通道阻斷劑組(carvacrol 500μmoL·L-1、2-APB 100μmoL·L-1)、黃芪甲苷(ASG Ⅳ)組(1μmoL·L-1、10μmoL·L-1)，后4組在加入 1μg· mL-1LPS的同時(shí)，分別給予500μmoL·L-1carvacrol、100μmoL·L-12-APB、1μmoL·L-1ASG Ⅳ、10μmoL·L-1ASG Ⅳ，孵育72h，通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)TRPM7電流的變化，利用RT-PCR和Western Blot方法分別測(cè)定TRPM7通道的基因和蛋白的表達(dá)，利用MTT方法測(cè)定成纖維細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：與正常組相比,LPS兩個(gè)組的TRPM7電流大小及基因、蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);與模型組相比,carvacrol、2-APB通道阻斷劑組的電流大小、基因和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01);此外,ASG Ⅳ 對(duì)電流、基因和蛋白表達(dá)也有不同程度的抑制作用(P<0.05)。模型組的成纖維細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于其他組(P<0.01)，通道阻斷劑組及黃芪甲苷組均能不同程度抑制細(xì)胞的異常增殖(P<0.01)。結(jié)論：脂多糖(LPS)能夠使成纖維細(xì)胞上TRPM7電流大小及通道表達(dá)上調(diào)，且該上調(diào)能增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，而ASG Ⅳ能通過(guò)下調(diào)TRPM7表達(dá)抑制成纖維細(xì)胞的增殖。

LPS；成纖維細(xì)胞；TRPM7；黃芪甲苷

心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts)的異常增殖是心肌纖維化的重要病理基礎(chǔ)。成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts)是心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，生理狀態(tài)下主要起心臟結(jié)構(gòu)支撐的作用；以往的研究忽視了其在病理狀態(tài)下的作用，事實(shí)上，在氧化應(yīng)激、炎癥刺激、細(xì)胞因子、機(jī)械牽拉等多種病理狀態(tài)的刺激下，成纖維細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化成具有更強(qiáng)增殖、分泌、遷移功能的肌成纖維細(xì)胞(cardiac myofibroblasts)，該細(xì)胞是纖維化病理過(guò)程的重要參與者。TRPM7是瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel TRP)家族的成員之一，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等作用[1]。文獻(xiàn)報(bào)道稱，炎癥性心肌病發(fā)生時(shí)常伴隨著心肌纖維化，而由TRPM7通道介導(dǎo),炎性介質(zhì)影響細(xì)胞增殖的現(xiàn)象多見(jiàn)于其他組織和細(xì)胞類型[2-4]，影響心肌成纖維細(xì)胞增殖的相關(guān)報(bào)道較少。黃芪甲苷(Lipopolysaccharide LPS)是具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制細(xì)胞異常增殖等多重作用的中藥活性成分[5-6]。有研究顯示，黃芪甲苷可抑制心肌纖維化的進(jìn)程[7]，從而起到預(yù)防和治療心肌肥厚、心力衰竭等心臟疾病的作用，但其抑制纖維化的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚。

脂多糖是致炎因子，常見(jiàn)于誘導(dǎo)炎癥病理模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂多糖對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，想進(jìn)一步證明脂多糖是否能夠引起心臟成纖維細(xì)胞的異常增生，同時(shí)探討該異常增生是否由TRPM7的通道上調(diào)所引起，以及黃芪甲苷對(duì)該過(guò)程的抑制作用。

1 材料與試劑

1.1 藥品

脂多糖(美國(guó)Sigma公司)；黃芪甲苷(南京澤瑯公司)；2-APB(美國(guó)Sigma 公司)；Carvacrol(美國(guó)Sigma 公司)；TRPM7蛋白一抗(美國(guó)ABCAM公司)；兔抗GAPDH一抗(Bioworld公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒(Thermo Scientific公司)，其余試劑為市售分析純。

1.2 溶液配置

細(xì)胞外液：葡萄糖10mmoL·L-1;NaCl 140mmoL·L-1；CsCl 5mmoL·L-1；HEPES 10mmoL·L-1；CaCl21.8mmoL·L-1；MgCl21 mmoL·L-1，調(diào)節(jié)pH到7.3～7.4。

電極內(nèi)液:Cs-SO3CH3115mmoL·L-1；NaCl 8mmoL·L-1；HEPES 10mmoL·L-1；EGTA-Cs 10mmoL·L-1；用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2左右。

1.3 儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientifica公司)； EPC-10型膜片鉗放大器(德國(guó)Heka公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)eppendorf公司)；分子酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；DYCP-40C電泳槽( 北京市六一儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生時(shí)間為1～3天的SD大鼠乳鼠10只，雌雄不限，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2013-0006。

2 方法

2.1 乳鼠成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

乳鼠處死后浸入75%乙醇溶液中消毒，取心臟，放入預(yù)冷的 D-Hanks 液沖洗掉多余的血，換至0.08%的胰酶中，剪成0.5～1.0mm3大小的碎塊，加新的胰酶在37℃中反復(fù)消化，收集每次的消化液，離心重懸后過(guò)200目不銹鋼網(wǎng)篩，將該細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱差速貼壁培養(yǎng)90 min，貼壁的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代時(shí)，再次利用差速貼壁法，得到純度為95%以上的成纖維細(xì)胞，用第二代成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組及給藥

將第二代的成纖維細(xì)胞分為7組：正常組、LPS 0.1μg·mL-1組、LPS 1μg·mL-1組、LPS 1μg·mL-1+carvacrol 500μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+2-APB 100μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+黃芪甲苷(ASG Ⅳ)1μmoL·L-1組、LPS 1μg·mL-1+黃芪甲苷(ASG Ⅳ)10μmoL·L-1組，后4組在加入 1μg·mL-1LPS的同時(shí)，分別給予500μmoL·L-1carvacrol、100μmoL·L-12-APB、1μmoL·L-1ASG Ⅳ、10μmoL·L-1ASG Ⅳ，孵育72h后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.3 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

玻璃電極兩步拉制法拉制，拋光后灌充以電極內(nèi)液，用入水后電阻值為2～5MΩ的電極進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。封接和破膜后，補(bǔ)償慢電容和串聯(lián)電阻，消除電容瞬跡，進(jìn)行全細(xì)胞模式的紀(jì)錄。Pulse軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(23～25℃)下進(jìn)行。

2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)

用蛋白裂解液分別提取每組細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定濃度并分裝，取總蛋白40g與5×SDS上樣緩沖液混合，經(jīng)8% SDS-PAGE分離膠電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2h，用TRPM7一抗(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 500)室溫孵2h，ECL法顯影，GAPDH作為內(nèi)參。Image J 軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平，重復(fù)3次。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因檢測(cè)

各組細(xì)胞用PBS洗兩遍后，加入Trizol試劑，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，通過(guò)在260nm處的吸光度值來(lái)確定RNA純度，2μg總RNA按照第一鏈cDNA合成試劑盒(first Strand cDNA Synthesis Kit，AMV)說(shuō)明書(shū)用于逆轉(zhuǎn)錄，取1μL的cDNA產(chǎn)物用于每個(gè)PCR反應(yīng)，用擴(kuò)增試劑盒(Maxima SYBR Green Qpcr MM，ROX)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。選GAPDH基因作內(nèi)參基因。通過(guò)2^-ΔΔCt方法處理，基因序列由上海生工有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物寡核苷酸序列

2.6 MTT測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔越10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200μL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，換不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)72h。每孔加MTT溶液(5mg·mL-1用PBS配制，pH=7.4)20μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加150μL DMSO，搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，記錄結(jié)果。

2.7 數(shù)據(jù)處理

全細(xì)胞膜片鉗所有數(shù)據(jù)均使用Pulse軟件進(jìn)行紀(jì)錄，采用Graphypad prism 5.0和sigmaplot10.0來(lái)分析數(shù)據(jù)和曲線擬合。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用mean±SD表示，組間均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脂多糖促細(xì)胞增殖及藥物干預(yù)作用

低劑量(0.1μg·mL-1、1μg·mL-1)的LPS能增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖能力 (P<0.01)，給予TRPM7通道阻斷劑的兩組細(xì)胞增殖能力有明顯下調(diào)(P<0.05)，結(jié)果顯示黃芪甲苷也有不錯(cuò)的抑制異常增殖的能力(P<0.01)，且高濃度(10μmoL·L-1)的黃芪甲苷具有更好的抑制作用(見(jiàn)表1)。

表1 各組成纖維細(xì)胞增殖能力比較 (n=3)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 成纖維細(xì)胞的TRPM7基因和蛋白表達(dá)量的變化

RT-PCR結(jié)果和western blot的結(jié)果均顯示，與正常組相比，脂多糖(LPS)兩個(gè)組(0.1μg· mL-1、1.0μg· mL-1)的TRPM7 mRNA量有顯著升高，且高濃度組(1μg· mL-1)上調(diào)更明顯(P<0.01)。而LPS+carvacrol組和 LPS+2-APB組的TRPM7基因和蛋白表達(dá)量低于模型組(P<0.01)，略高于正常組。黃芪甲苷的兩組(1μmoL·L-1、10μmoL·L-1)對(duì)TRPM7的表達(dá)均有抑制作用(P<0.01)，且具有一定程度的濃度依賴性(見(jiàn)圖1)。

3.3 成纖維細(xì)胞的TRPM7通道電流變化

在0mV的鉗制電壓下給予從-100mV至+120mV的階躍為20mV的一系列去極化刺激，經(jīng)分析處理得到電流密度圖(n=7)，與正常組相比，LPS組的TRPM7電流密度曲線隨電壓絕對(duì)值的增大有顯著升高(圖2-A)。而與模型組相比，LPS+carvacrol組和LPS+2-APB組的電流密度曲線隨著電壓絕對(duì)值的增加有明顯減小(圖2-B)。黃芪甲苷組對(duì)電流也有明顯抑制作用，且高濃度組更顯著(圖2-C)。

4 討論

纖維化的主要表征是細(xì)胞外膠原的過(guò)度沉積和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增多，而成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后，其分泌膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)，該過(guò)程是纖維化病理過(guò)程中的重要一環(huán)。在心臟纖維化過(guò)程中有多重因素的參與，如炎癥、氧化應(yīng)激、高壓等，脂多糖是常用的炎癥誘導(dǎo)因子，能引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖能在肺部、肝部、腎部引起成纖維細(xì)胞的異常增殖，但不同組織的成纖維細(xì)胞反應(yīng)及機(jī)制不同[8-10]。

圖1 不同組TRPM7的mRNA和蛋白表達(dá)量的變化(n=3)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 不同組TRPM7電流變化的電流密度曲線(n=7)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS 1μg·mL-1組比較，*P<0.05，**P<0.01。

本文通過(guò)脂多糖炎癥模型，研究炎癥對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，且通過(guò)TRPM7通道的相關(guān)研究，進(jìn)一步說(shuō)明TRPM7通道參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖作用。TRPM7是一個(gè)分布廣泛且對(duì)多種陽(yáng)離子具有通透性的非電壓依賴性離子通道。該通道的活性受多種因素調(diào)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)，TRPM7參與多種生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生發(fā)展，如胚胎細(xì)胞的發(fā)育與增殖、腫瘤的增殖與遷移、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與損傷、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖等。因此，心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展也可能與TRPM7通道的表達(dá)功能的調(diào)控相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心臟的成纖維細(xì)胞在低濃度脂多糖(0.1 μg·mL-1、1μg·mL-1)的誘導(dǎo)下有明顯的異常增殖現(xiàn)象，給予TRPM7通道阻斷劑2-APB和carvacrol，均能使該增殖受到明顯抑制，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)脂多糖模型組的TRPM7基因和蛋白表達(dá)量、電流大小均有不同程度顯著升高，且高濃度的上調(diào)變化更明顯(1μg·mL-1)，這種同向變化的現(xiàn)象說(shuō)明，脂多糖引起的成纖維細(xì)胞異常增殖可能與TRPM7的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

黃芪甲苷是常見(jiàn)的抗炎中藥提取物，本實(shí)驗(yàn)采用高低兩個(gè)劑量，發(fā)現(xiàn)與脂多糖組(1μg·mL-1)相比黃芪甲苷確能在一定程度上抑制成纖維細(xì)胞的異常增殖，且具有濃度依賴性；同時(shí)，根據(jù)PCR和蛋白電泳結(jié)果，黃芪甲苷對(duì)TRPM7基因和蛋白的表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)作用，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示黃芪甲苷能抑制TRPM7電流的增大，此外，黃芪甲苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的異常增殖也有顯著的抑制作用。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明，黃芪甲苷對(duì)脂多糖引起的成纖維細(xì)胞增殖具有抑制作用，該作用可能與下調(diào)TRPM7有關(guān)。

黃芪甲苷[11]是常見(jiàn)中藥活性成分，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有多種藥理活性，其中抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗病毒等作用明顯，有相關(guān)研究顯示，黃芪甲苷能抑制成纖維細(xì)胞的異常增殖，在其他組織和器官的抑制纖維化作用也十分明顯[12-13]，但其抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用報(bào)道較少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明了黃芪甲苷能抑制心肌成纖維細(xì)胞的異常增殖，且該增殖是由TRPM7通道調(diào)控的。其中的機(jī)制可能與黃芪甲苷抑制自由基生成和抑制炎性因子作用相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)TRPM7通道的上游調(diào)控因子，影響TRPM7通道的表達(dá)及功能，進(jìn)而參與成纖維細(xì)胞的分化、增殖的調(diào)控，但具體藥理機(jī)制需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)來(lái)深入探討。

由于心臟纖維化發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，導(dǎo)致很多藥物的治療效果欠佳。而中藥提取物具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的特點(diǎn)，在治療心血管疾病方面具有更大優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)選擇黃芪甲苷作為治療藥物，是由于其在抑制纖維化的同時(shí)具有保護(hù)心肌細(xì)胞[14]、抑制心肌凋亡、抗心肌肥厚[15]的作用，在臨床上具有更全面的治療心臟纖維化發(fā)展的作用。黃芪甲苷抑制由TRPM7介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的作用會(huì)為將來(lái)黃芪甲苷的抗纖維化藥理作用機(jī)制及臨床治療心臟纖維化提供新的思路和理論依據(jù)。但由于本實(shí)驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)，未來(lái)還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)TRPM7參與纖維化的作用做進(jìn)一步研究。

近年來(lái)關(guān)于TRPM7通道的研究越來(lái)越多，其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、鎂平衡等重要生理功能也逐漸被認(rèn)識(shí)，相信未來(lái)關(guān)于TRPM7通道的研究勢(shì)必會(huì)成為熱點(diǎn)，為多種疾病的臨床治療提供更多的幫助和啟示。

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(責(zé)任編輯：余 婷)

Effects of TRPM7 on Cardiac Fibrosis and Drug Intervention

Zhou Yang,Lei Quan,Guo Qiao,Liu Yonghui,Wang Xinwei,Tang Yiqun*

(Department of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Objective:To investigate the effects of Lipopolysaccharide(LPS) and the inhibitory effects of astragaloside Ⅳ(ASG Ⅳ) on the proliferation of cardiac fibroblasts through TRPM7 channel.Methods:Cardiac fibroblasts obtained from neonatal SD rats were cultured in vitro divided into 7 groups,control group,model groups(LPS 0.1μg·mL-1,1μg·mL-1),TRPM7 channel blocker groups(carvacrol 500 μmoL·L-1,2-APB 100 μmoL·L-1),ASG Ⅳ treatment groups(1μmoL·L-1,10μmoL·L-1).The treatment groups were administered with 1 μg·mL-1LPS and treated respectively with 500μmoL·L-1carvacrol,100μmoL·L-12-APB,1μmoL·L-1ASG Ⅳ,10μmoL·L-1ASG Ⅳ.Each group was incubated for 72 hours.The changes of gene and protein expression,channel current,cell proliferation before and after administration were measured respectively by RT-PCR,western blot,whole cell patch clamp and MTT.Results:RT-PCR and western blot results showed that LPS had significantly upregulated the gene and protein expression of TRPM7(P<0.01) and carvacrol,2-APB,ASG Ⅳ inhibited the increase on different levels.Patch clamp data revealed that there was a decrease of TRPM7 current in LPS +carvacrol group,LPS+2-APB group and LPS+ASG Ⅳgroup compared with model group.Furthermore,ASG Ⅳ markly prevented the proliferation of cardiac fibroblasts induced by LPS(P<0.01).Conclusion:We demonstrate that TRPM7 channels contributed to LPS induced cardiac fibroblasts proliferation and suggest that this contribution may be suppressed by ASG Ⅳ through inbibition of TRPM7 channel.

LPS ；Cardiac Fibroblasts；TRPM7；ASG Ⅳ

2015-08-05

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)課題(2011ZX09401-021)

周陽(yáng)(1990-)，女，中國(guó)藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樾难芩幚怼?/p>

湯依群(1967-),女，中國(guó)藥科大學(xué)副教授，研究方向?yàn)樾难芩幚怼?/p>

R285

A

1673-2197(2015)23-0001-04

10.11954/ytctyy.201523001