馬中雨，陳家全，陳興廳，宋武昌，逯南南，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250021

生物監(jiān)測(cè)預(yù)警是一種利用魚類、發(fā)光菌、水蚤等受試生物作為生物傳感器監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化、判斷其是否受到污染并對(duì)污染程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。魚類對(duì)水環(huán)境的變化非常敏感，在外部環(huán)境壓力下，魚類的行為會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，所以，通過監(jiān)測(cè)魚類的行為變化可以實(shí)現(xiàn)水質(zhì)污染事件的在線報(bào)警。目前，魚類行為生態(tài)學(xué)是國內(nèi)外科研工作者研究的焦點(diǎn)之一［1-5］，國內(nèi)外已經(jīng)有多種生物魚在線監(jiān)測(cè)預(yù)警系統(tǒng)應(yīng)用于水質(zhì)在線監(jiān)測(cè)［6-9］，但是斑馬魚在水質(zhì)生物預(yù)警系統(tǒng)中的應(yīng)用研究報(bào)道較少。該研究以斑馬魚為受試生物，利用水質(zhì)在線生物安全預(yù)警系統(tǒng)分析斑馬魚在6種環(huán)境污染物下的行為變化及系統(tǒng)報(bào)警特征，為飲用水水源突發(fā)水污染的生物監(jiān)測(cè)預(yù)警提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

在斑馬魚行為在線監(jiān)測(cè)中，采用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)(BEWs-3，中國科學(xué)院生態(tài)研究中心研制，示意圖見圖1)進(jìn)行。該系統(tǒng)主要由生物傳感器、信號(hào)采集處理系統(tǒng)、信號(hào)分析評(píng)估系統(tǒng)及顯示器組成。其預(yù)警原理是在一定環(huán)境壓力下，生物行為反應(yīng)是外界環(huán)境和內(nèi)部生理變化的外在體現(xiàn)，所以生物行為變化可以起到環(huán)境變化警示作用，通過生物行為監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在線監(jiān)測(cè)斑馬魚在水體污染情況下行為強(qiáng)度變化，達(dá)到監(jiān)測(cè)被測(cè)水體污染狀況的目的。在斑馬魚行為監(jiān)測(cè)過程中，采用直徑為5 cm、長7 cm的圓柱形生物傳感器。

圖1 水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)示意圖

1.2 受試生物

斑馬魚(Zebrafish)，屬真骨魚總目、鯉科，是一種敏感的水生模式生物，其生物學(xué)背景研究充分，對(duì)多種有毒化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境污染物敏感，被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織列為毒性實(shí)驗(yàn)受試種之一，國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于多種有毒化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。因此，選擇斑馬魚為生物傳感器開展研究工作。選擇的斑馬魚長(30±5)mm、重(0.3 ±0.1)g。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用動(dòng)態(tài)水流監(jiān)測(cè)斑馬魚的行為反應(yīng)。在污染物暴露實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)黃河下游地區(qū)引黃供水系統(tǒng)水源濁度高、同時(shí)面臨有機(jī)物和重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)的情況，選擇濁度、亞硝酸鹽氮、石油類、苯、砷化物、錳等6個(gè)指標(biāo)，分別測(cè)試其對(duì)斑馬魚的行為毒性。實(shí)驗(yàn)過程中，為了明確生物綜合行為的變化，采用生物綜合行為強(qiáng)度(Behavior Strength)來反映其行為變化，在此過程中，判斷生物行為強(qiáng)度發(fā)生劇烈變化的標(biāo)準(zhǔn):變化以前連續(xù)5次行為強(qiáng)度平均值與變化以后連續(xù)5次行為強(qiáng)度平均值差異達(dá)到20%以上。

在受試生物動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)開始每個(gè)通道保持2條體長2.5～3 cm的受試魚，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中不喂食，并控制每個(gè)通道水流量為2 L/h。

實(shí)驗(yàn)過程中生物暴露的污染物濃度參考《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)III類水體中限值以及生物監(jiān)測(cè)方法的靈敏度2個(gè)因素，除濁度和苯外，其他指標(biāo)均選擇標(biāo)準(zhǔn)濃度的5倍和10倍，濃度設(shè)置見表1。

采用地表水加標(biāo)方式調(diào)整實(shí)驗(yàn)濃度，加標(biāo)物質(zhì)及其參數(shù)如表2所示。在不同濃度污染物暴露過程中采用6組平行，監(jiān)測(cè)周期24 h，并通過平均值反映斑馬魚的行為反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)斑馬魚的敏感性。

表1 實(shí)驗(yàn)中各污染物濃度設(shè)置

表2 加標(biāo)物質(zhì)及其參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚在不同污染物下的行為變化

利用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)分別測(cè)定了斑馬魚在濁度、石油類、亞硝酸鹽氮、砷、錳、苯6個(gè)指標(biāo)下的行為強(qiáng)度變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2～圖7，圖中各對(duì)照均為純水。

由圖2可以看出:在濁度為10.1 NTU時(shí)，斑馬魚行為強(qiáng)度沒有受到顯著的影響;而當(dāng)濁度為53.8 NTU時(shí)，斑馬魚在暴露11 h后行為強(qiáng)度開始緩慢下降，2 h后行為強(qiáng)度降到最低，下降幅度為13.7%，其后行為強(qiáng)度緩慢恢復(fù)?？傮w上看，濁度為10、53.8 NTU的水溶液對(duì)斑馬魚行為強(qiáng)度的影響不顯著。

當(dāng)斑馬魚在石油類質(zhì)量濃度為0.25 mg/L的水體中暴露時(shí)，10 h后行為強(qiáng)度開始緩慢下降;暴露21 h后，行為強(qiáng)度恢復(fù)到初始狀態(tài)，未出現(xiàn)報(bào)警信息;而在石油類質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的水體中暴露時(shí)，4 h后行為強(qiáng)度開始下降，22 h后行為強(qiáng)度恢復(fù)到開始狀態(tài)，也未出現(xiàn)報(bào)警信息，見圖3。可見，石油類對(duì)斑馬魚行為強(qiáng)度的影響有一定的劑量效應(yīng)。

圖2 斑馬魚在不同濁度下行為變化情況

圖3 斑馬魚在不同濃度石油類條件下行為變化情況

圖4 斑馬魚在不同濃度亞硝酸鹽氮條件濁度下行為變化情況

圖5 斑馬魚在不同濃度錳條件下行為變化情況

圖6 斑馬魚在不同濃度砷條件下行為變化情況

圖7 斑馬魚在不同濃度苯條件下行為變化情況

由圖4可知，斑馬魚在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為5 mg/L的溶液中暴露24 h后，沒有明顯差異，未出現(xiàn)報(bào)警;而在濃度質(zhì)量達(dá)到10 mg/L時(shí)暴露10 h后即出現(xiàn)報(bào)警。

斑馬魚分別暴露在質(zhì)量濃度為0.5 mg/L和1 mg/L的錳溶液中時(shí)，分別暴露1 h和1.5 h后即出現(xiàn)報(bào)警，除對(duì)照外其余通道魚全部死亡，結(jié)果見圖5。這說明生物魚系統(tǒng)對(duì)重金屬錳的靈敏性較好，反應(yīng)敏感。

由圖6可見，斑馬魚在砷質(zhì)量濃度為0.25 mg/L的溶液中暴露1 h后行為強(qiáng)度開始緩慢下降，7 h后斑馬魚行為強(qiáng)度降到0.2以下，全部死亡，0.5 h后即出現(xiàn)報(bào)警。在砷質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)暴露10 min后行為強(qiáng)度開始下降，1.2 h后行為強(qiáng)度下降到0.2以下，除對(duì)照外均死亡，1.7 h后出現(xiàn)報(bào)警。可見，斑馬魚對(duì)砷反應(yīng)的劑量效應(yīng)非常明顯。

由圖7可見，斑馬魚在質(zhì)量濃度為0.25、0.5 mg/L苯溶液中暴露時(shí)，均有報(bào)警，報(bào)警時(shí)間分別是實(shí)驗(yàn)開始后14.25和3 h，2種濃度下均全部死亡;隨著苯濃度的提高，對(duì)其行為的影響也顯著增強(qiáng)。這說明苯對(duì)斑馬魚具有較高的毒性。

在24 h暴露過程中，對(duì)照組內(nèi)斑馬魚行為未隨時(shí)間的變化而發(fā)生行為強(qiáng)度的明顯升高或降低，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在同一污染物暴露下，生物行為強(qiáng)度隨暴露時(shí)間變化而變化，也會(huì)隨暴露濃度的變化而變化。在濁度、石油類、亞硝酸鹽氮、苯、砷、錳等高濃度的污染水體暴露下，斑馬魚的行為強(qiáng)度都有所下降，下降幅度分別為13.7%、37.7%、35.4%、62.1%、90%、95%，而在較低濃度的污染水體中，斑馬魚行為強(qiáng)度下降幅度分別為0、18.6%、0、10.2%、90%、95%，結(jié)果見表 3。

表3 斑馬魚在各污染物暴露下的行為強(qiáng)度變化分析

由表3可見，不同的污染物及其濃度對(duì)斑馬魚的行為強(qiáng)度產(chǎn)生了不同的影響，反映了不同污染物對(duì)斑馬魚毒性作用的不同，而這也為利用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化、判斷水質(zhì)污染物的類型提供了線索。

2.2 在線生物預(yù)警系統(tǒng)報(bào)警特征與斑馬魚行為變化之間的關(guān)系

在水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)中，生物魚是整個(gè)系統(tǒng)的生物傳感器，其作用是感知水質(zhì)變化，并通過行為上的變化來反映水質(zhì)的變化。生物魚行為變化的極端情況是在污染物毒性作用下失去行為能力甚至死亡。在實(shí)驗(yàn)中，生物魚的死亡率與預(yù)警系統(tǒng)的報(bào)警結(jié)果見表4。

由表4可以看出，不同污染物對(duì)斑馬魚的毒性作用存在較大差異。在濁度、石油類的低濃度和高濃度溶液中，受試生物魚死亡率均為0;在亞硝酸鈉氮、苯的低濃度溶液中，受試生物魚未見死亡，在高濃度溶液中，均有死亡;在砷和錳的高、低濃度溶液中，受試生物魚死亡率為100%。這一結(jié)果與生物魚行為強(qiáng)度的變化相吻合。生物預(yù)警系統(tǒng)出現(xiàn)報(bào)警的情況與生物魚死亡的情況具有很好的相關(guān)性。生物預(yù)警系統(tǒng)不僅能夠在受試生物魚全部死亡時(shí)報(bào)警，而且在生物魚因?yàn)槎拘晕镔|(zhì)的作用出現(xiàn)部分死亡時(shí)也能夠報(bào)警，而在沒有生物魚死亡的情況下無報(bào)警。另外，對(duì)于不同類型的污染物，儀器出現(xiàn)報(bào)警的反應(yīng)時(shí)間也不同。例如:在0.5 mg/L亞硝酸鈉氮溶液中，暴露10 h后儀器發(fā)出報(bào)警;而在0.5 mg/L錳溶液中，暴露1 h后即發(fā)出報(bào)警。這一結(jié)果也與生物魚行為強(qiáng)度變化相吻合。

表4 不同污染狀況下斑馬魚行為變化及在線報(bào)警特征

3 討論

在線生物監(jiān)測(cè)技術(shù)通過生物傳感器監(jiān)測(cè)水體內(nèi)受試水生生物不同水平上的生物學(xué)指標(biāo)變化，預(yù)警水質(zhì)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的在線監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)對(duì)水環(huán)境污染與否、污染的嚴(yán)重性做出在線評(píng)價(jià)。該技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)國家應(yīng)用于水體突發(fā)性污染事故的在線預(yù)警［10-13］。在線生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的核心是通過生物傳感器監(jiān)測(cè)到在環(huán)境污染物壓力下的各種生物信號(hào)，經(jīng)過處理器處理以后，再由計(jì)算機(jī)將處理后的數(shù)字信息以可視信號(hào)顯示出來，達(dá)到在線生物監(jiān)測(cè)的目的。大量的研究表明［14-16］，生物的行為生態(tài)學(xué)變化與環(huán)境污染物壓力存在顯著的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明:生物魚的行為生態(tài)學(xué)變化與環(huán)境壓力大小直接相關(guān)，在高濃度污染物的環(huán)境內(nèi)，生物魚的行為生態(tài)學(xué)出現(xiàn)劇烈變化;生物魚的行為生態(tài)學(xué)變化與在一定壓力環(huán)境內(nèi)的暴露時(shí)間直接相關(guān)，隨著暴露時(shí)間的增長，生物魚的行為生態(tài)學(xué)變化會(huì)逐漸降低;生物魚的行為生態(tài)學(xué)變化隨環(huán)境壓力的變化而不同。

不同地區(qū)的地表水水質(zhì)具有不同的特征性污染物，如濟(jì)南的引黃水庫水具有高藻、高有機(jī)物的水質(zhì)特征［17］。根據(jù)本研究結(jié)果，按照斑馬魚行為強(qiáng)度及報(bào)警時(shí)間，可以將濁度、石油、亞硝酸鹽、苯、砷、錳劃分為3類指標(biāo):濁度和石油，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)斑馬魚行為強(qiáng)度影響較小，生物魚未出現(xiàn)死亡和報(bào)警情況;亞硝酸鹽氮和苯，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)斑馬魚的行為強(qiáng)度影響居中，都只在高濃度下報(bào)警;砷和錳，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)生物魚行為強(qiáng)度影響最顯著，報(bào)警時(shí)間也較短。所以，在利用在線監(jiān)測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)水源水質(zhì)時(shí)，要結(jié)合當(dāng)?shù)氐乃|(zhì)特征開展研究，對(duì)設(shè)備預(yù)警參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定更加符合水質(zhì)特征的報(bào)警閾值。

另外，斑馬魚是熱帶魚種，存在對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的問題，應(yīng)該加強(qiáng)研究，開發(fā)適合當(dāng)?shù)氐聂~種，應(yīng)用于水質(zhì)安全預(yù)警。

4 結(jié)論

斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)變化與環(huán)境污染物壓力存在顯著的相關(guān)性。斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)變化與環(huán)境壓力大小直接相關(guān)，在高濃度污染物的環(huán)境內(nèi)，斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)出現(xiàn)劇烈變化;斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)變化與在一定壓力環(huán)境內(nèi)的暴露時(shí)間直接相關(guān)，隨著暴露時(shí)間的增長，斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)變化會(huì)逐漸降低;斑馬魚的行為生態(tài)學(xué)變化隨環(huán)境壓力的變化而不同;水質(zhì)在線生物安全預(yù)警系統(tǒng)對(duì)不同類型污染物的反應(yīng)靈敏度不同，應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)氐乃|(zhì)特征設(shè)定報(bào)警閾值。

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