李 甜，朱新榮，張 建，田童童

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆新春36號(hào)黑小麥中硒的分布及富硒蛋白提取工藝研究

李 甜，朱新榮*，張 建*，田童童

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

為了探究新疆新春36號(hào)黑小麥中硒的分布，本實(shí)驗(yàn)通過單因素及響應(yīng)面分析法對硒蛋白、硒多糖、硒核酸及不同溶解性的硒蛋白做了系統(tǒng)考察。結(jié)果表明：36號(hào)黑小麥中硒蛋白、硒多糖及硒核酸中硒的含量分別為（240.52± 0.3）、（32.45±0.21）、（4.65±0.05）mg/g；堿溶性、水溶性、醇溶性和鹽溶性硒蛋白的含量分別為（146.21±0.3）、（41.52± 0.6）、（19.40±0.06）、（13.65±0.12）mg/g。堿溶性硒蛋白的最佳提取條件為：NaOH溶液濃度0.17 mol/L，酸化pH4.7，（NH4）2SO4飽和度為66.0%，料液比為1∶10。該條件下模型預(yù)測堿溶性硒蛋白的提取率為76.5593%，實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為76.7%。

硒蛋白，分布，提取率

硒元素是人體必需的常量礦物質(zhì)營養(yǎng)素，在保健和預(yù)防疾病方面具有非常重要的作用[1]。當(dāng)硒缺乏的時(shí)候，就很容易導(dǎo)致人體免疫能力下降，威脅人類健康。生命的四十多種疾病都與人體缺硒有關(guān)，如克山病、大骨病、癌癥、心血管病、生殖系統(tǒng)疾病等癥狀[2-5]。植物是人類最直接的、最廣泛的食物來源，也是自然界中硒循環(huán)的重要載體，且植物硒的生態(tài)效價(jià)高于動(dòng)物硒，所以植物有機(jī)硒成分的分離及其生物活性等各方面也得到了廣泛的研究[6]。

元素硒于1817年被瑞典化學(xué)家Berzelius發(fā)現(xiàn)[7]。然而從第一個(gè)硒蛋白被發(fā)現(xiàn)以來，生物學(xué)和醫(yī)學(xué)界的科研人員通過不懈努力，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)多種硒蛋白。并且最近幾年，從富硒靈芝、食用菌、煙草中提取硒蛋白或者含硒蛋白的相關(guān)研究成果在國內(nèi)一些科研雜志中報(bào)道[8-11]。

然而，小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，也是最有效的硒積累作物和含硒食物來源。新疆新春36號(hào)是新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所歷時(shí)10年選育而成的新疆內(nèi)第1個(gè)黑小麥新品種。該品種生長旺盛，抗病、抗倒，微量元素含量豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，產(chǎn)值比普通春小麥高。其中硒含量為95 mg/g，處在世界平均水平（20～150 mg/g）中上之間，因此，新疆新春36號(hào)黑小麥?zhǔn)菍ふ椅鞍椎牧己觅Y源[12-13]。

目前國內(nèi)外對新春36號(hào)黑小麥的研究主要集中在對其特征特性及栽培技術(shù)方面的研究，有關(guān)新春36號(hào)黑小麥硒的分布情況和蛋白質(zhì)提取的研究很少，因此，本課題以新疆新春36號(hào)黑小麥為研究對象，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿溶性硒蛋白的提取工藝，并且對優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗(yàn)考察以驗(yàn)證響應(yīng)面模型的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新春36號(hào)黑小麥 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師農(nóng)科所提供；氯化鈉、氫氧化鈉、三氯甲烷、正丁醇、鹽酸、無水乙醇、95%乙醇、硫酸銨、冰乙酸等 均為分析純。

85-1磁力攪拌器 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；FZ-6粉碎機(jī) 上海百豐粉碎食品機(jī)械有限公司；BL-206-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；BS210S精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HSG-IIC4恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市儀器制造有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-1電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；2000D超純水器 北京長風(fēng)儀器儀表公司；BSC-3L冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 新疆新春36號(hào)黑小麥顆粒用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過60目篩備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取粉碎后的黑小麥樣品10 g，加入100 mL 0.10mol/L NaOH溶液，室溫下攪拌提取4 h，濾液經(jīng)乙酸（HAc）酸化至pH為4.5后添加（NH4）2SO4至飽和度為50%，4℃靜置12 h，3000×g離心20 min，離心沉淀溶解在0.1 mol/L NaOH溶液中，Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中4℃透析24 h，真空冷凍干燥得到堿溶性硒蛋白樣品。

控制其他條件不變，選取NaOH溶液濃度、酸化pH、（NH4）2SO4飽和度、料液比和提取時(shí)間作為五個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將NaOH溶液分別設(shè)定為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L 5個(gè)不同濃度梯度，酸化pH設(shè)定為4.1、4.3、4.5、4.7、4.9不同梯度，（NH4）2SO4飽和度分別設(shè)定為30%、40%、50%、60%、70%的5個(gè)不同水平，料液比分別設(shè)定為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12不同水平，提取時(shí)間分別設(shè)定為1、2、3、4、5 h不同水平，所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)Box-Bbehnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以堿溶性硒蛋白的提取率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對NaOH溶液濃度、酸化pH、（NH4）2SO4飽和度和料液比值四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法來優(yōu)化堿溶性硒蛋白質(zhì)的提取工藝條件。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 The range of independent variables and their corresponding levels

1.3 測定指標(biāo)與方法

硒蛋白、硒多糖、硒核酸、水溶性硒蛋白、鹽溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白及堿溶硒蛋白的含量測定依據(jù)已報(bào)到的文獻(xiàn)[14-15，17-18]。硒含量及硒蛋白中氨基酸含量的測定參考林向成[19]和Yeo JK[16]報(bào)道的方法。

1.4 堿溶性硒蛋白提取率的計(jì)算

堿溶性硒蛋白提取率（%）=堿溶性硒蛋白的提取量/黑小麥樣品的質(zhì)量×100

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并且用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析（p≤0.05），所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆新春36號(hào)黑小麥各組分中硒的分布

表2 新疆新春36號(hào)黑小麥各組分中硒的分布結(jié)果Table 2 Se’s distribution in group of the Triticale of Xinchun No.36 in Xinjiang province

從表2可以得知，新春36號(hào)黑小麥中硒的分布情況為硒蛋白（240.52±0.3）mg/g、硒多糖（32.45± 0.21）mg/g、硒核酸（4.65±0.05）mg/g。

表3 硒在新疆新春36號(hào)黑小麥蛋白中的分布情況Table 3 Distribution of Se in protein-bound of the Triticale of Xinchun No.36 in Xinjiang province

2.2 硒在新疆新春36號(hào)黑小麥蛋白中的分布

由表3可以得知，新春36號(hào)黑小麥中硒在不同蛋白中的分布情況為堿溶性蛋白（146.21±0.3）mg/g、水溶性蛋白（41.52±0.6）mg/g、醇溶性蛋白（19.40± 0.06）mg/g、鹽溶性蛋白（13.65±0.12）mg/g。

表4 硒蛋白中各種氨基酸含量Table 4 The contents of amino acids in selenoprotein

2.3 硒蛋白中各種氨基酸含量的測定

由表4可知，新疆新春36號(hào)黑小麥硒蛋白中氨基酸種類豐富，其中，賴氨酸的含量在所有氨基酸中最高，達(dá)到9.58%左右，而胱氨酸的含量為0，這可能是由于小麥中的硒取代了胱氨酸中的硫而生成硒代胱氨酸或者硒代半胱氨酸[20]，從而導(dǎo)致了胱氨酸的含量為0。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 NaOH溶液濃度對堿溶性蛋白提取的影響 由圖1可知，黑小麥中堿溶性硒蛋白的含量隨著NaOH溶液濃度的增大而增大，當(dāng)NaOH溶液濃度為0.15 mol/L時(shí)，黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取率達(dá)到最高，能達(dá)到77.5%。實(shí)驗(yàn)過程中，NaOH溶液濃度不能太高，這是因?yàn)楫?dāng)NaOH溶液濃度超過0.25 mol/L時(shí)，NaOH溶液和黑小麥粉末的混合溶液會(huì)變得很粘稠，對實(shí)驗(yàn)操作帶來很大的影響，并且黑小麥中的蛋白質(zhì)會(huì)很可能發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子遭到破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率明顯降低。綜合考慮，單因素實(shí)驗(yàn)中制備堿溶性硒蛋白的最佳NaOH溶液濃度為0.15 mol/L。

圖1 NaOH溶液濃度對堿溶性蛋白提取的影響Fig.1 Effect of concentration of NaOH on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.2 酸化pH對堿溶性蛋白提取的影響 由圖2可知，隨著酸化pH不斷升高，堿溶性硒蛋白的提取率也隨之升高，當(dāng)pH達(dá)到4.7時(shí)，新春36號(hào)黑小麥中的堿溶性硒蛋白的提取率最大，達(dá)到78.5%；但當(dāng)酸化pH大于4.7時(shí)，堿溶性硒蛋白的提取率呈現(xiàn)出略微下降的趨勢。這可能是因?yàn)楦咚嵝运庖菏沟梦鞍椎慕Y(jié)構(gòu)解聚從而使其富集而發(fā)生沉淀現(xiàn)象，從而使蛋白的提取率呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢。然而在pH為4.7時(shí)提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)槲鞍椎牡入婞c(diǎn)大概在此附近。另外，當(dāng)pH大于4.7時(shí)，硒蛋白在此水解條件下的溶解性可能最差，因此其提取率隨之下降。綜合考慮，單因素實(shí)驗(yàn)中制備堿溶性硒蛋白的最佳酸化pH為4.7。

圖2 酸化pH對堿溶性硒蛋白提取的影響Fig.2 Effect of acid pH on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.3 （NH4）2SO4飽和度對堿溶性蛋白提取的影響由圖3可知，黑小麥中堿溶性硒蛋白的含量隨著（NH4）2SO4飽和度增大而增大，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度為60%時(shí)，堿溶性硒蛋白的提取率達(dá)到最大，能達(dá)到73.5%；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度繼續(xù)增大時(shí)，堿溶性硒蛋白的提取率沒有明顯的變化。這可能是因?yàn)閴A溶性硒蛋白在（NH4）2SO4飽和度為60%的條件下溶解性較差，所以被析出；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白的析出量已達(dá)到最大，此時(shí)（NH4）2SO4飽和度對蛋白析出的影響不顯著。因此，制備堿溶性硒蛋白的（NH4）2SO4飽和度為60%時(shí)提取效果最好。

圖3 （NH4）2SO4飽和度對堿溶性硒蛋白提取的影響Fig.3 Effect of saturation of（NH4）2SO4on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.4 料液比對堿溶性蛋白提取的影響 由圖4可見，隨著料液比的升高，黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取率逐漸增大。當(dāng)料液比越低時(shí)，黑小麥粉末樣品與NaOH溶液的混合液粘度越大；當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，堿溶性硒蛋白的提取率最大，達(dá)到70.3%；在料液比大于1∶10時(shí)，隨著加NaOH溶液量的增加，堿溶性硒蛋白的提取率變化不大。這可能是由于在料液比較低時(shí)，樣品達(dá)到最大溶解度，但是樣品并未全部溶解到NaOH溶液中，造成了樣品的浪費(fèi)；而當(dāng)料液比大于1∶10時(shí)，所加樣品在NaOH溶液中充分溶解，部分NaOH溶液未起到提取的作用，造成藥品浪費(fèi)。綜合考慮，單因素實(shí)驗(yàn)中制備堿溶性硒蛋白的最佳料液比為1∶10。

圖4 料液比對堿溶性硒蛋白提取的影響Fig.4 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.5 提取時(shí)間對堿溶性蛋白提取的影響 由圖5可見，提取時(shí)間在1～3 h之間時(shí)，黑小麥中堿溶性硒蛋白的含量隨著提取時(shí)間的增加而增加；當(dāng)提取時(shí)間超過3 h時(shí)，堿溶性硒蛋白的提取率隨著提取時(shí)間增加沒有顯著變化。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是提取時(shí)間太短，對蛋白的提取不充分；而提取時(shí)間過長時(shí)，對蛋白的提取已達(dá)到最高水平，繼續(xù)提取只是時(shí)間的浪費(fèi)。綜合考慮，單因素實(shí)驗(yàn)中提取堿溶性硒蛋白的最佳提取時(shí)間為3 h。

圖5 提取時(shí)間對堿溶性硒蛋白提取的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以NaOH溶液濃度（A）、酸化pH（B）、（NH4）2SO4飽和度（C）、料液比（D）為響應(yīng)變量，以堿溶性硒蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.05軟件，通過表5中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得堿溶性硒蛋白的提取率多元線性回歸方程：

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

Y=73.84＋5.59A＋3.17B＋4.33C＋2.32D-1.92AB＋1.70AC-2.85AD-2.38BC-1.40BD-1.08CD-7.83A2-3.67B2-3.74C2-4.85D2

由表6可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（p＜0.0001），其R2為0.9620，這表明黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取率有96.20%來源于所選變量，即NaOH溶液濃度、酸化pH、（NH4）2SO4飽和度、料液比。因此，此模型擬合情況較好，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素，因此各實(shí)驗(yàn)因素對堿溶性硒蛋白的提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。根據(jù)回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖見圖6（A、B）。

圖6（A）為NaOH濃度與料液比對堿溶性硒蛋白提取率的影響。隨著NaOH濃度的升高，堿溶性硒蛋白的提取率先增大后減??；隨著料液比的增大，該提取率逐漸增大，而當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，提取率沒有明顯的增大或者減小。從響應(yīng)曲面圖可以看出曲面的坡度比較陡。這表明NaOH濃度與料液比二者的交互作用較顯著。

表6 回歸模型的方差和顯著性分析結(jié)果Table 6 Coefficient and significance of regression model

圖6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取硒蛋白曲面圖Fig.6 The response surface on extraction alkali-soluble selenoprotein

圖6（B）為酸化pH與硫酸銨飽和度對堿溶性硒蛋白提取率的影響。堿溶性硒蛋白的提取率隨著酸化pH的逐漸升高，呈上升趨勢；隨著硫酸銨飽和度的增大，該提取率也呈上升趨勢。從圖6B可以看出曲面的坡度比較陡。這說明酸化pH與硫酸銨飽和度二者的交互作用是較明顯的。

通過軟件分析，得到黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取的最佳工藝條件為NaOH溶液濃度：0.17 mol/L、酸化pH4.72、硫酸銨飽和度：66.30%、料液比1∶10.07，該條件下黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取率預(yù)測值為76.5593%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得的結(jié)果的可靠性，采取上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將堿溶性硒蛋白的提取條件修正為NaOH溶液濃度0.17 mol/L、酸化pH4.7、硫酸銨飽和度66.0%、料液比1∶10，此時(shí)提取率76.7%。該值與理論最大值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取工藝可行。

3 結(jié)論

硒的分布結(jié)果表明，在黑小麥中硒蛋白的含量最高為（240.52±0.3）mg/g；在黑小麥的各類硒蛋白中，堿溶性硒蛋白的含量最高為（146.21±0.3）mg/g。在本課題中還對硒蛋白中的各種氨基酸含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，在硒蛋白中所含氨基酸的種類很豐富，硒蛋白中胱氨酸的含量卻為0，可能是因?yàn)槲〈穗装彼嶂械牧蚨晌装彼峄蛘呶腚装彼?，這需要進(jìn)一步的探討與研究。

通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對蛋白質(zhì)的提取率進(jìn)行了優(yōu)化，得出新春36號(hào)黑小麥中堿溶性硒蛋白的提取最優(yōu)條件是：NaOH溶液濃度為0.17 mol/L、酸化pH為4.7、硫酸銨飽和度為66.0%、料液比為1∶10，此條件下堿溶性硒蛋白的提取率為76.7%。

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Study on the distribution and the extraction process of rich proteins of Xinchun No.36 Triticale in Xinjiang province

LI Tian，ZHU Xin-rong*，ZHANG Jian*，TIAN Tong-tong
（Food College of Shihezi University，Shihezi 832000，China）

The purpose of this work was to study the distribution of Se in Xinchun No.36 triticale in Xingjiang province.Through single factor experiment and response surface method，a systematic inspection of selenoproteins，selenium polysaccharide，selenium nucleic acid and selenoproteins of solubility in different solvents was made.The results showed that content of selenoproteins，selenium ploysaccharide and nucleic acid selenium was（240.52±0.3），（32.45±0.21）and（4.65±0.05）mg/g respectively.The content of selenoproteins of alkali-soluble，water-soluble，salt-soluble and alcohol-soluble was（146.21±0.3），（41.52±0.6），（19.40±0.06）and（13.65±0.12）mg/g respectively.Furthermore，in order to get more alkali-soluble selenoproteins，the optimal extraction technology was obtained by the single factor test and the response surface design experiments.The optimal extraction conditions were NaOH 0.17 mol/L，acidification at pH4.7，saturation of（NH4）2SO466.0%，the ratio of solid to liquid 1∶10，the predicted rate of protein extraction was 76.5593%，but the actual value of experiment reached 76.7%.

selenoproteins；distribution；rate of extraction

TS210.1

B

1002-0306（2015）22-0267-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.047

2015－03－04

李甜（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：464828569@qq.com。

*通訊作者：朱新榮（1977-），女，講師，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：1678481898@qq.com。

張建（1979-），男，副教授，研究方向：食品生物化學(xué)，E-mail：zhangjian0411@163.com。

石河子大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2014ZRKXYQ14）；石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)（3152SPXY01027）。