計曉曼，馬傳國，王化林

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

酶改性大豆分離蛋白起泡性能的研究

計曉曼，馬傳國*，王化林

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

使用堿性蛋白酶對大豆分離蛋白進行改性，以改善蛋白質(zhì)的起泡性能。探討酶水解過程中的酶解時間、酶解溫度、底物濃度、加酶量、pH對蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響，在此基礎(chǔ)上通過正交實驗確定了堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白提高起泡能力的最優(yōu)水解條件：時間40 min、溫度50℃、底物濃度8%、加酶量0.04%、pH8，提高泡沫穩(wěn)定性最佳水解條件：時間30 min、溫度40℃、底物濃度6%、加酶量0.04%、pH9。測定上述條件下大豆分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別為217.50%和93.10%。改性前后蛋白質(zhì)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均有所改善，與未改性蛋白相比起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別提高了61.11%和20.38%。

堿性蛋白酶，大豆分離蛋白，起泡能力，泡沫穩(wěn)定性

大豆蛋白質(zhì)是人們常用的植物性蛋白，具有人體所需的8種必須氨基酸，同時能降低人體膽固醇含量[1]，是為數(shù)不多的可取代動物性蛋白的大宗植物性蛋白[2]。近年來，大豆加工技術(shù)和水平不斷提高，良好的營養(yǎng)價值和功能性促進了大豆蛋白的消費[3]。大豆蛋白質(zhì)分子中含有兩親基團，蛋白質(zhì)分散液在受到攪打時，大量氣體混入，蛋白質(zhì)分子能在水相中吸附至氣-液界面，降低表面張力，形成氣泡，使大豆蛋白具有起泡性能[4]。大豆蛋白的起泡性能包括起泡能力（foaming capacity）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability）。大豆蛋白質(zhì)的起泡性在食品的各個領(lǐng)域得到應用，但仍存在一些缺陷不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)[5]。

改善蛋白質(zhì)起泡性能的方法有很多，最常用的是物理改性（加熱、高壓等）、化學改性（磷酸化、酯化等）和酶改性[6]。酶改性因其污染少、效率高得到廣泛應用[7]。酶改性是利用蛋白酶的水解作用將蛋白質(zhì)分子內(nèi)切或外切成較小分子，增加蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)或特殊基團的功能，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[8]。酶改性過程中蛋白質(zhì)被水解，能有效提高蛋白質(zhì)吸附至液面的能力[9]。

目前很多有關(guān)蛋白質(zhì)改性研究，但多數(shù)研究綜合考慮蛋白質(zhì)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，而對某些特定產(chǎn)品往往需要最佳的起泡能力或泡沫穩(wěn)定性，同時起泡能力和泡沫穩(wěn)定性之間通常是相反的，兩者受不同分子性質(zhì)影響[10]，同時考慮需要兩者的折中，不能最優(yōu)化。本實驗對蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別進行研究，通過堿性蛋白酶對蛋白質(zhì)進行改性，分析改善蛋白質(zhì)起泡性的最優(yōu)方案，以期為食品工業(yè)利用高起泡性或高泡沫穩(wěn)定性改性蛋白質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 谷神生物科技集團有限公司，蛋白含量89.8%；堿性蛋白酶 200000 U/g，西亞試劑；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純。

FA-25高剪切分散乳化機 上海弗魯克有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)酶解反應 稱取蛋白質(zhì)配成一定濃度，加入緩沖鹽調(diào)節(jié)一定pH，在80℃下預熱10 min，加入一定蛋白酶在一定溫度下反應一定時間，反應結(jié)束沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫。

1.2.2 起泡性能測定 采用攪打后溶液泡沫體積衡量大豆蛋白的起泡性能。具體測定方法如下：將酶解液定容至1%（w/v），4000 r/min離心20 min。取酶解上清液20 mL于100 mL小燒杯中，攪打2 min，立即移入100 mL量筒中，分別記錄攪打停止時液面高度V1和30 min后液面高度V2。未水解蛋白質(zhì)直接制成1%溶液，測定方法同上[11]。

起泡能力（Foaming Capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（Foaming Stability，F(xiàn)S）按如下公式計算：

1.2.3 酶解單因素考察 取不同酶解時間、酶解溫度、底物濃度、加酶量、pH為考察因素，以起泡能力、泡沫穩(wěn)定性為指標進行單因素實驗。

酶解時間：選擇時間為20、30、40、50、60、70 min，在溫度60℃、底物濃度6%、加酶量0.16%、pH8條件下進行酶解。

酶解溫度：選擇溫度為30、35、40、45、50、55、60、65℃，在時間30 min、底物濃度6%、加酶量0.16%、pH8條件下進行酶解。

酶解底物濃度：選擇底物濃度為2%、4%、6%、8%、10%，在時間30 min、溫度45℃、加酶量0.16%、pH8條件下進行酶解。

酶添加量：選擇酶添加量為0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%（w/v），在時間30min、溫度45℃、底物濃度6%、pH8條件下進行酶解。

酶解pH：選擇pH6、7、8、9、10，在時間30 min、溫度45℃、底物濃度6%、加酶量0.08%條件下進行酶解。

在單因素基礎(chǔ)上考察不同因素對起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響，分別選取相對應的影響趨勢較明顯的四個因素進行正交實驗。

1.2.4 酶解條件優(yōu)化

1.2.4.1 起泡能力的優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗變化趨勢，發(fā)現(xiàn)pH對起泡能力影響趨勢最弱，以起泡能力為指標，固定pH8，對酶解時間（A）、酶解溫度（B）、底物濃度（C）、酶添加量（D）進行L9（34）正交實驗（表1）。

1.2.4.2 泡沫穩(wěn)定性的優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗得到底物濃度對泡沫穩(wěn)定性影響趨勢最弱，選擇底物濃度為6%，對酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶添加量（C）、pH（D）進行正交實驗，對泡沫穩(wěn)定性進行優(yōu)化（表2）。

表1 起泡能力正交實驗因素水平設(shè)計Table 1 The factors and levels of foaming capacity orthogonal experimental design

表2 泡沫穩(wěn)定性正交實驗因素水平設(shè)計Table 2 The factors and levels of foaming stability orthogonal experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 未酶解蛋白質(zhì)起泡性能測定

對原料蛋白質(zhì)溶液的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性進行測定，分別為135.00%、77.34%。

2.2 酶解時間對起泡性能的影響

圖1 酶解時間對起泡性能的影響Fig.1 Effect of time on foaming property

由圖1可知，隨著酶解時間增加，蛋白質(zhì)的起泡性能有所改變。起泡能力在20～40 min內(nèi)變化較明顯，之后趨于平緩，在30 min時達到最大，說明在30 min時蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子肽能迅速在界面展開。泡沫穩(wěn)定性在前30～50 min內(nèi)變化明顯，在40 min達到最大，說明在此區(qū)域水解產(chǎn)生的蛋白肽分子量最為適宜[12]。

2.3 酶解溫度對起泡性能的影響

由圖2可知，蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均在45℃左右達到最大。這可能由于溫度過高時不利于酶的水解，而一定程度的水解使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團暴露，增加其吸附至界面的能力。同時45℃酶解液產(chǎn)生的泡沫時，粘度較其他酶解液大，這對泡沫穩(wěn)定性有利[13]。

2.4 底物濃度對起泡性能的影響

由圖3可知，隨著底物濃度的增加，蛋白質(zhì)的起泡能力變化較明顯，而泡沫穩(wěn)定性在6%以后趨于平緩。這可能與蛋白質(zhì)與酶結(jié)合存在最佳比例有關(guān)，一定范圍內(nèi)增加底物濃度能促進酶解，當兩者充分結(jié)合后，底物濃度繼續(xù)增加反而不利于水解。一定濃度蛋白質(zhì)能增加界面張力，同時分子間形成膠束防止聚集沉淀，增加起泡性能[11]。

圖2 酶解溫度對起泡性能的影響Fig.2 Effect of temperature on foaming property

圖3 底物濃度對起泡性能的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on foaming property

2.5 加酶量對起泡性能的影響

圖4 加酶量對起泡性能的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on foaming property

由圖4可知，蛋白質(zhì)的起泡能力隨加酶量增加先增加后平緩，泡沫穩(wěn)定性先增加后降低。隨著加酶量增加，更有利于生成促進起泡性能的小分子量產(chǎn)物，但加酶量超過一定限度會造成過度水解?？梢娂用噶吭?.08%時，產(chǎn)生的分子量大小最適宜。

2.6 pH對起泡性能的影響

由圖5可知，隨著pH增加蛋白質(zhì)的起泡能力變化不大，而泡沫穩(wěn)定性在pH7～9之間增加顯著。這主要與酶的最適pH有關(guān)，pH變化影響分子構(gòu)象和酶、底物的解離狀態(tài)，一方面影響兩者的相互作用，一方面改變蛋白質(zhì)分子的柔性，從而對蛋白質(zhì)的起泡性能造成影響。還可能是在pH9環(huán)境下水解產(chǎn)物更不易聚集沉降，從而增大了泡沫穩(wěn)定性[14]。

圖5 pH對起泡性能的影響Fig.5 Effect of pH on foaming property

2.7 正交實驗

2.7.1 起泡能力的優(yōu)化 結(jié)果見表3。根據(jù)R值可知，對蛋白質(zhì)起泡能力影響大小排序為B溫度＞C底物濃度=D加酶量＞A時間。由k值可得最優(yōu)組合為A2B3C3D1或者A3B3C3D1，因A2A3的起泡能力相差甚小，且從經(jīng)濟角度出發(fā)，最終確定為A2B3C3D1，即時間40 min，溫度50℃，底物濃度8%，加酶量0.04%，驗證實驗表明大豆分離蛋白的起泡能力可達217.50%。

表3 起泡能力正交實驗結(jié)果Table 3 The results of foaming capacity orthogonal experiment

2.7.2 泡沫穩(wěn)定性的優(yōu)化 由表4可知，對蛋白質(zhì)起泡能力影響大小排序為B溫度＞A時間＞D pH＞C加酶量，最優(yōu)組合為：A1B1C1D3，即時間30 min，溫度40℃，加酶量0.04%，pH9，測定此條件下大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性為93.1%。

3 結(jié)論

本文使用堿性蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，單因素實驗顯示通過水解其起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均得到改善。在單因素基礎(chǔ)上，選取對起泡能力、泡沫穩(wěn)定性影響明顯的四個因素進行正交實驗，得到起泡能力在時間40 min、溫度50℃、底物濃度8%、加酶量0.04%、pH8條件下達到最優(yōu)，而泡沫穩(wěn)定性在時間30 min、溫度40℃、底物濃度6%、加酶量0.04%、pH9條件下達到最優(yōu)。改性前大豆蛋白的起泡能力為135.00%，泡沫穩(wěn)定性為77.34%；改性后大豆蛋白的起泡能力為217.50%，泡沫穩(wěn)定性為93.10%。

表4 泡沫穩(wěn)定性正交實驗結(jié)果Table 4 The results of foaming stability orthogonal experiment

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Study on foaming property of enzyme modified soy protein isolated

JI Xiao-man，MA Chuan-guo*，WANG Hua-lin
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

In this paper，the effect of the foaming property of soybean protein isolated was improved by using the alkali protease to hydrolysis protein.And several influencing factors were discussed in this paper，such as reaction time，temperature，substrate concentration，enzyme dosage，and pH value.Then by the orthogonal design method the optimal conditions of alkali protease hydrolysis soybean protein isolated to improve foaming property was：time 40 min，temperature 50℃，substrate concentration 8%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH8. The optimal hydrolysis conditions to improve the foaming stability was：time 30 min，temperature 40℃，substrate concentration 12%，enzyme dosage 0.04%（w/v），pH9.The foaming capacity（217.50%）and foaming stability（93.10%）of modified soybean protein isolated was improved in this study.The foaming capacity and the stability was increased by 61.11%and 20.38%respectively than the raw material of soybean protein.

alcalase；soybean protein isolated；foaming capacity；foaming stability

TS252

A

1002-0306（2015）22-0164-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.026

2015－02－02

計曉曼（1990-），女，碩士，研究方向：油脂蛋白品質(zhì)分析，E-mail：jixiaoman0222@163.com。

*通訊作者：馬傳國（1966-），男，博士，教授，研究方向：脂質(zhì)化學品質(zhì)研究，E-mail：mcg66@163.com。

國家863項目（2013AA102208）。