奚宇蘭，任建東，田伏洲，何 菱

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都 610041;2.成都軍區(qū)總醫(yī)院，四川成都 610083)

Scheme 1

急性胰腺炎是臨床常見急腹癥之一，死亡率高達10% ～50%［1］。針對急性胰腺炎發(fā)病機制［2－3］，學(xué)者們將研究重點放在胰蛋白酶抑制劑上，確定其與胰蛋白酶的確切結(jié)合位點［4－6］。結(jié)果表明，帶羥基的小分子抑制劑與胰蛋白酶結(jié)合后，羥基與蛋白質(zhì)氨基酸殘基Ser195，His57和水分子以三個以上的短氫鍵結(jié)合，提高了抑制劑與胰蛋白的親和力，從而增強抑制活性［7］。但伴隨的脫水作用可能會降低配體與受體的親和力［8］，影響最終的療效。

萘莫司他(NMT)是常用的胰蛋白酶抑制劑，抑制活性高，作用強而持久，是治療急性胰腺炎最重要的藥物之一。為進一步提高NMT的抑制活性，本文借助計算機輔助藥物設(shè)計法(分子對接法autodock)，結(jié)合藥物設(shè)計理論，對NMT進行優(yōu)化設(shè)計和構(gòu)效關(guān)系研究(Chart 1)，以期合成具有高抑制活性的胰蛋白酶抑制劑。即以6－氰基－2－萘酚為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)制得6－羥基－2－萘甲脒甲磺酸鹽(2);2分別與芳酸(1a～1h)反應(yīng)，合成了8個萘甲脒蛋白酶抑制劑(3a～3h，Scheme 1);硝基化合物(4)經(jīng)還原反應(yīng)合成了1個嘧啶胰蛋白酶抑制劑(3i，Scheme 1)。以鄰胺基苯酚為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)合成了1個嘧啶胰蛋白酶抑制劑(3j，Scheme 1)。3b～3f為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR 和 HR－ESI－MS 表征。并研究了3a～3j對胰蛋白酶的抑制活性。

Chart 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標);Aglient－6890型質(zhì)譜儀;分子模擬工作站(聯(lián)想深騰1800型服務(wù)器，Autodock 4.0，Chimera，Accelrys DS Visualizer模擬軟件)。

1a～1h，自制;其余所用試劑均為分析純。

1.2 分子模擬和化合物虛擬篩選

根據(jù)已有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，采用Chimera剝離配體和胰蛋白酶受體后新建單獨的小分子配體數(shù)據(jù)庫和大分子受體數(shù)據(jù)庫。使用Autodock對接配體和相應(yīng)受體，依據(jù)運算結(jié)果驗證能量匹配和構(gòu)象匹配后，確定1 mtu為最優(yōu)大分子蛋白質(zhì)受體母體。運用Autodock進行分子對接運算，詳細分析配體與受體結(jié)合的活性位點和氨基酸殘基特征。受體蛋白除去原始配體和水分子后，添加極性氫并加載AM1－BCC電荷。配體經(jīng)分子力學(xué)優(yōu)化后，添加極性氫并加載AM1－BCC電荷。用Autogrid 4.0 計算格點能量［40 ? ×40 ? × 40 ?，格點間隔 0.375 ?，中心坐標(－ 3.578，6.338，26.415)］。分子對接運算采用 Lamarckian遺傳算法(對接循環(huán)參數(shù)200，其余參數(shù)為默認值)，配體和受體間的結(jié)合情況采用半經(jīng)驗自由能計算方法。具體運算用Autodock 4.0完成。采用分子對接算法分析現(xiàn)有藥物與胰蛋白酶受體的結(jié)合模式，比較NMT在受體活性位點的對接運算構(gòu)象(圖1)以及胰蛋白酶與配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，可驗證文獻報道的活性位點特征。

根據(jù)結(jié)合自由能和分子受體活性位點氨基酸殘基的結(jié)合情況，選擇了10個具有代表性的脒基胍基取代的芳環(huán)化合物(3a～3h)，用于下一步的合成和體外活性測試。

圖1 NMT與胰蛋白酶相互作用模式Figure 1 The interactive model between NMT and trypsin

1.3 合成

(1)2的合成

冰浴冷卻下，在反應(yīng)瓶中加入甲醇50 mL，通入干燥 HCl氣體至飽和;加入 6－氰基－2－萘酚 8.5 g(50 mmol)，攪拌下于室溫反應(yīng)過夜。減壓濃縮蒸除甲醇和殘余HCl;殘余物用甲醇50 mL溶解后，于50℃通入干燥氨氣，反應(yīng)3 h。減壓濃縮，劇烈攪拌下向殘余物中加入飽和碳酸氫鈉溶液，析出固體，過濾，濾餅用水洗滌，干燥得粗品;加入甲醇10 mL，冰浴冷卻下滴加甲磺酸5.8 g(60 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)0.5 h。加入乙醚，析出固體，過濾，濾餅用乙醚洗滌，無水乙醇重結(jié)晶得白色固體2。

(2)3a～3h的合成(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4－(4－硝基芐氨基)苯甲酸60 mg(0.22 mmol)，2 75 mg(0.27 mmol)和無水吡啶5 mL，攪拌使其溶解;加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)54 mg和 4－二甲氨基吡啶(DMAP)2.7 mg，于室溫反應(yīng)過夜。減壓蒸除吡啶，殘余物經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑A:V(氯仿)∶V(甲醇)=20∶1］純化得白色固體3a。

用類似的方法合成白色固體3b～3h。

3a:1H NMR δ:9.50(s，2H)，9.22(s，2H)，8.55(s，1H)，8.24(d，J=8.8 Hz，2H)，8.16(t，J=8.8 Hz，2H)，7.92 ～7.85(m，4H)，7.64 ～7.55(m，4H)，6.72(d，J=8.8 Hz，2H)，4.59(d，J=6.0 Hz，2H);13C NMR δ:166.0，164.8，155.6，153.5，151.2，148.1，146.8，136.0，132.3，131.0，129.8，129.7，128.6，128.4，125.4，124.6，124.0，123.9，119.2，115.2，112.0，45.4;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C25H20N4O4{［M+H］+}441.156 3，found 441.155 4。

3b:1H NMR δ:9.49(s，2H)，9.14(s，2H)，8.56(s，1H)，8.23 ～8.16(m，2H)，8.00(d，J=2.4 Hz，1H)，7.89 ～ 7.85(m，2H)，7.77(d，J=2.4 Hz，1H)，7.66 ～7.63(m，1H)，7.49(t，J=7.2 Hz，4H)，7.37 ～7.26(m，7H)，6.85(d，J=9.6 Hz，1H)，6.81(d，J=9.6 Hz，1H)，6.62 ～6.54(m，2H)，4.91(d，J=5.6 Hz，2H)，4.87(d，J=5.6 Hz，2H);13C NMR δ:166.0，164.6，153.4，151.0，148.1，136.4，136.3，136.0，133.5，133.1，131.2，130.0，129.8，129.0，128.8，128.4，128.3，126.9，126.8，125.7，125.0，124.8，124.6，123.8，121.1，119.3，114.8，113.4，68.5，69.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C36H30N2O4{［M+H］+}，555.228 4，found 555.226 0。

3c:1H NMR δ:9.32(s，4H)，8.54(s，1H)，8.16(t，J=9.2 Hz，2H)，7.92 ～7.85(m，4H)，7.57(dd，J=2.0 Hz，8.8 Hz，1H)，7.47 ～ 7.37(m，5H)，6.71(d，J=8.8 Hz，2H)，4.41(d，J=6.0 Hz，2H);13C NMR δ:165.9，164.8，156.0，153.6，151.3，138.6，136.0，132.2，131.7，131.0，129.8，129.7，129.3，128.7，125.5，124.6，124.0，119.2，114.8，111.9，45.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C25H20N3O2Cl{［M+H］+}430.132 2，found 430.131 7。

3d:1H NMR δ:11.37(s，1H)，9.57(s，2H)，9.31(s，2H)，8.60(s，1H)，8.33 ～ 8.16(m，7H)，8.01(s，1H)，7.91 ～7.89(m，3H)，7.67 ～7.65(m，1H)，3.90(s，2H);13C NMR δ:166.0，164.4，150.9，144.0，136.0，131.6，131.2，130.0，129.9，128.7，125.4，124.8，123.8，123.5，119.3，119.1，41.5;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C20H18N4O3{［M+H］+}363.145 7，found 363.146 5。

3e:1H NMR δ:10.6(s，1H)，8.78(s，4H)，8.58(s，1H)，8.23 ～8.14(m，4H)，8.01(d，J=2.0 Hz，1H)，7.88(d，J=9.2 Hz，3H)，7.67 ～7.64(m，1H)，2.86(t，J=7.6 Hz，2H)，2.54(t，J=7.6 Hz，2H)，1.93 ～1.88(m，2H);13C NMR δ:171.6，166.0，164.4，150.9，144.8，136.0，131.4，131.1，130.0，129.8，128.7，125.4，124.7，123.8，122.7，119.3，118.8，38.5，33.5，23.2;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C22H22N4O3{［M+H］+}391.177 0，found 391.176 9。

3f:1H NMR δ:9.85(s，1H)，9.55(s，3H)，9.30(s，2H)，8.59(s，1H)，8.24 ～ 8.19(m，2H)，7.95(s，1H)，7.90(d，J=8.8 Hz，1H)，7.59(d，J=8.8 Hz，1H)，4.46(t，J=9.6 Hz，1H)，3.00 ～ 3.02(m，2H)，1.99 ～ 1.66(m，6H);13C NMR δ:167.9，165.9，149.8，135.8，131.6，130.3，129.9，128.8，125.9，125.0，123.0，119.0，56.1，43.8，40.0，25.8，21.5;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H19N3O2{［M+H］+}298.155 6，found 298.156 1。

3g:1H NMR δ:9.52(s，2H)，9.30(s，2H)，8.93(s，2H)，8.60(s，1H)，8.26 ～ 8.07(m，5H)，7.91(s，1H)，7.72(s，1H);13C NMR δ:165.9，163.9，151.3，150.4，136.4，135.8，131.3，130.2，129.8，128.8，125.9，124.9，123.4，123.3，119.2;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H13N3O2{［M+H］+}292.108 6，found 292.109 0。

3h:1H NMR δ:9.51(s，2H)，9.33(d，J=1.6 Hz，1H)，9.17(s，2H)，8.94(dd，J=1.6 Hz，4.4 Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.54(dt，J=2.0 Hz，8.0 Hz，1H)，8.25 ～ 8.18(m，2H)，8.07(d，J=2.0 Hz，1H)，7.90 ～7.88(m，1H)，7.74 ～7.69(m，2H);13C NMR δ:166.0，162.5，150.4，147.7，143.3，135.9，131.6，130.4，130.0，129.8，129.0，127.6，126.7，126.1，125.0，123.4，119.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H13N3O2{［M+H］+}292.108 6，found 292.108 2。

(3)4的合成

在反應(yīng)瓶中加入對硝基苯甲酸100 mg(0.66 mmol)，2－氨基嘧啶60 mg(0.63 mmol)和干燥吡啶9 mL，攪拌使其溶解;加入 DCC 250 mg和DMAP 7 mg，于室溫反應(yīng)24 h。減壓蒸除吡啶，殘余物經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑B:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶1］純化得白色固體4。

(4)3i的合成

在反應(yīng)瓶中加入4 474 mg(2 mmol)，甲醇6 mL和水6 mL，攪拌使其形成懸浮液;加入鐵粉761 mg，于室溫滴加數(shù)滴冰醋酸，滴畢，回流(100℃)反應(yīng)1.5 h。冷卻至室溫，濾除過量鐵粉，濾液減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:B=30 ∶1)純化得類白色固體 3i。1H NMR δ:10.46(s，1H)，8.68 ～8.67(m，1H)，7.72(d，J=8.0 Hz，2H)，7.19 ～7.17(m，1H)，8.56(d，J=8.0 Hz，2H)，5.85(s，2H);13C NMR δ:165.4，158.9，158.5，153.0，130.5，120.5，116.9，112.8;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C11H10N4O{［M+H］+}215.093 3，found 215.093 9。

(5)3j的合成

冰浴下，在反應(yīng)瓶中加入鄰胺基苯酚140 mg(1.28 mmol)，Boc－硫脲 357 mg(1.29 mmol)和DMF(2.1ml)，攪拌使其溶解;加入三乙胺 0.42 mL，緩慢滴加氯化汞385 mg的 DMF(1 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)1h;于室溫反應(yīng)18 h。旋干，固體用濃鹽酸/乙酸乙酯(V∶V=1∶1)0.5 mL溶解;攪拌0.5 h，用碳酸氫鈉調(diào)至pH 6～7，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=9∶1)純化得到黃色固體3j。1H NMR δ:10.22(s，1H)，9.30(s，1H)，7.36(s，2H)，7.18 ～7.03(m，3H)，6.84(t，J=7.2 Hz，1H)，3.60(s，1H);13C NMR δ:156.7，152.8，128.7，127.8，121.9，119.6，116.8;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C7H9N3O{［M+H］+}152.082 4，found 152.082 3。

表1 3a～3j對胰蛋白酶的抑制活性Table 1 The inhibitory activities of 3a～3j against trypsin

2 結(jié)果與討論

2.1 分子模擬

分子模擬與實驗結(jié)果產(chǎn)生偏差的原因主要有:(一)Autodock評價結(jié)合自由能的精確度有限制。Autodock只能將受體作為剛性體，而不能評價柔性受體與配體發(fā)生誘導(dǎo)契合時的能量變化;(二)準備過程中除去了水分子，Autodock的運算結(jié)果不能反映水分子在配體與受體結(jié)合過程中的作用;(三)Autodock運算時無法預(yù)測化合物的理化性質(zhì)。因此，根據(jù)實驗經(jīng)驗和藥物設(shè)計理論，通過優(yōu)化方案，設(shè)計并合成了3d和3e。

3d和3e對接到胰蛋白酶的活性位點，形成低能量構(gòu)象。3a～3j在S1位點的結(jié)合模式都是高度保守的，配體的脒基和受體的氨基酸殘基Asp189形成鹽橋，并由氫鍵進一步穩(wěn)定。3d和3e與原配體 BX5633相比，S3位點的 Asn97和Ser96氨基酸殘基與配體氨基增加了氫鍵作用，側(cè)鏈更長，與S1位點結(jié)合更加緊密。此外，3d和3e還與S2位點的His57和Ser195氨基酸殘基產(chǎn)生了相互作用，形成新增氫鍵。以上因素均可能是3d和3e活性提高的原因。

2.2 抑制活性

為驗證分子模擬設(shè)計結(jié)果，以NMT為對照組，考察了3a～3j對胰蛋白酶的抑制活性，結(jié)果見表1。

由表 1 可見，6－甲脒基－2－萘酚 4－(4－氨基丁酰胺)苯甲酸酯(3e)對胰蛋白酶的抑制活性最好，其IC50為0.352 μg·mL－1，優(yōu)于 NMT(IC500.451 μg·mL－1)。3d抑制活性也較好，值得進一步對其活性和副作用進行探索。

3 結(jié)論

通過計算機輔助設(shè)計，合成了10個胰蛋白酶抑制劑(3a～3j)，其中3b～3f為新化合物。體外活性測試表明:6－甲脒基－2－萘酚 4－(4－氨基丁酰胺)苯甲酸酯(3e)對胰蛋白酶有較好的抑制活性，其 IC50為 0.352 μg·mL－1，優(yōu)于奈莫司他(IC500.451 μg·mL－1)。

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