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·專家對談錄·

迎接高通量測序技術診斷兒童遺傳性疾病的新時代

夏 凡 教授周文浩 教授王慧君 副研究員

周文浩教授 非常榮幸能邀請到美國貝勒醫(yī)學院夏凡教授來復旦大學附屬兒科醫(yī)院講學，并就分子遺傳診斷中心的工作給予非常具體的指導。復旦大學附屬兒科醫(yī)院分子診斷實驗室已經(jīng)開展100余項基因檢測項目，應用Sanger測序、aCGH和MLPA等技術，建立了常見單基因遺傳病的篩查和診斷平臺，二代測序檢測項目也初步展開。全外顯子組測序(WES)技術，為尋找疾病的致病基因、易感基因等研究，提供了一種全新的研究方法。Science將WES評為“2010年世界十大科技進展”之一。

夏 凡教授 外顯子組(exome)即一個個體的基因組DNA上所有蛋白質編碼序列(外顯子)的總和。人類外顯子組序列僅占人類整個基因組序列的1%，約為30 Mb，包括約18萬個外顯子，估計85%的人類致病突變都位于這1%的蛋白質編碼序列上。

從近5年采用WES用于臨床診斷的文獻可以看出其應用的趨勢。2009年，HowardHughesMedicalInstitute報道了第1篇WES用于臨床診斷的文章；2010年，NatureGenetics發(fā)表了3個不同的家系應用WES進行臨床檢測的文章。2013年美國貝勒醫(yī)學院對250例先證者行WES臨床檢測，陽性率在25%，發(fā)表在NewEnglandJournalofMedicine。2014年，我們將病例進一步擴大到了2 000例，發(fā)表在JAMA上。估計在2015年三、四季度會出現(xiàn)全基因組序列分析(WGS)在臨床廣泛推廣的報道。

從已發(fā)表的文獻來看，采用WES進行臨床診斷的病例主要集中在兒科，比如發(fā)表在JAMA上的2 000例先證者，88%為兒科患者，平均年齡僅6歲。

周文浩教授 WES主要適用于兒科什么樣的疾?。?/p>

夏 凡教授 主要送檢的是神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育相關的疾病。當這些疾病通過常規(guī)篩查流程不能得到診斷時，醫(yī)生會考慮送檢WES。隨著WES檢測價格的降低和分析時間的縮短，WES有取代所有篩查性檢測手段的趨勢。對于臨床不能診斷的、需要快速明確病因的嚴重疾病，WES可以替代篩查檢測。美國貝勒醫(yī)學院附屬德克薩斯醫(yī)院新生兒科，在進行遺傳相關因素的探究中，多數(shù)直接送檢WES，爭取在最短的時間內(nèi)找到病因。對于可以治療的疾病，早期診斷對于預后的改善具有至關重要的意義。

周文浩教授 但針對新生兒人群進行WES檢測的研究依然比較少。

夏 凡教授 是的，美國貝勒醫(yī)學院的送檢人群中，新生兒也是比較少的。一方面，神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育相關疾病與遺傳緊密相關，臨床醫(yī)生容易認可和接受WES。另一方面，新生兒期的某些疾病(代謝性疾病)進展迅速，需要依靠快速出具報告的檢測方法，WES初期的確不能快速出具報告。隨著數(shù)據(jù)分析水平的提高、流程的完善，更能滿足臨床快速出具報告的需要，新生兒的送檢病例會迅速增加。

美國新生兒出生缺陷發(fā)生率約3%，既往僅依靠臨床表現(xiàn)、常規(guī)輔助檢查，約1%可以得到診斷。如果采用了WES、WGS及CGH檢測后，診斷率可以提升至2%～2.5%，WES檢測在新生兒疾病中還有巨大的潛力。

周文浩教授 我們課題組前期針對新生兒多發(fā)畸形，進行了染色體水平檢測：從目的片段拷貝數(shù)變異(即自行設計的多發(fā)畸形篩查MLPA試劑盒)到全基因組拷貝數(shù)變異檢測，總體陽性率約為25%。后續(xù)又對沒有檢測到拷貝數(shù)變異的病例，選擇性地進行了候選基因panel、WES檢測。對這種檢測策略可以給出哪些建議。

夏 凡教授 目前針對出生缺陷，可以有結構畸形及功能缺陷(肌肉松軟、驚厥等)。會有部分和染色體微重復/微缺失相關。從檢測成本和數(shù)據(jù)分析周期而言，也可以將拷貝數(shù)變異檢測作為第一步的檢測方法，這是合理的篩選流程。其實在美國貝勒醫(yī)學院，所有送檢WES的樣本，都會進行分辨率不是很高的SNP芯片檢測，可以比較全面的了解送檢樣本的分子遺傳學信息。①通過與WES檢測到的SNP分型的比較來確定樣本的一致性，②可以檢測到一些比較大的染色體微重復/微缺失。

王慧君副研究員 WES能不能在檢測外顯子組序列的同時也進行拷貝數(shù)變異的分析？

夏 凡教授 在美國貝勒醫(yī)學院進行的WES 檢測，平均覆蓋倍數(shù)在100×。由于WES技術本身的特點，必然存在一定的偏向性擴增。如果需要非常準確的檢測染色體微重復/微缺失，可能需要達到1 000×，成本將大幅度提升，性價比不高。WGS是可以將染色體微重復/微缺失和測序分析統(tǒng)一起來的技術。針對需要在短期內(nèi)快速得到更全面的信息，WGS可能是更好的選擇，隨著技術的不斷進步，價格的不斷降低，WGS必然會得到更廣泛的推廣。

單基因序列異常在分子遺傳學病因中占有很大比例，某些神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷，如單純驚厥、肌肉松軟等疾病，進行WES檢測就是很好的選擇，陽性率可以達到30%左右。

王慧君副研究員 復旦大學附屬兒科醫(yī)院分子診斷實驗室針對消化道結構畸形設計的Ion Torrent PGM平臺上6個基因的panel，MiSeq平臺針對缺氧耐受相關、驚厥相關目的基因panel和WES檢測分析。高通量測序對上述不同檢測方法分別的適應類型是什么？

夏 凡教授 具有典型臨床表型、候選基因單一的病例，可以直接進行該候選基因Sanger檢測；對于某個表型，候選基因數(shù)<20個，可采用panel進行檢測；當候選基因數(shù)>200個，從檢測成本而言就可以直接進行WES檢測；候選基因在20～200可根據(jù)情況權衡選擇。

王慧君副研究員 目前國際上WES檢測及數(shù)據(jù)分析的領跑者有哪些單位？

夏 凡教授 目前有美國的Genome Center at White Head/MIT、美國華盛頓大學基因中心，美國貝勒醫(yī)學院基因中心，英國的Sanger中心，中國的華大基因研究中心。其中美國貝勒醫(yī)學院和臨床的聯(lián)系最緊密，最先將基因組水平測序應用于臨床。目前美國主要數(shù)據(jù)分析中心有GeneDex、UCLA(偏重科研，強調病例的選擇)和Ambry Genetics等。數(shù)據(jù)分析常規(guī)所需要的時間是6周，最理想狀態(tài)下快速分析為2～3周。

周文浩教授 WES檢測的技術已經(jīng)非常成熟，決定并影響WES在臨床應用推廣的因素包括：臨床醫(yī)生對于該技術的認識、檢測的費用、數(shù)據(jù)分析方法和數(shù)據(jù)分析所需時間，上述4個因素中WES的數(shù)據(jù)分析可能最制約臨床推廣應用。

夏 凡教授 僅就WES檢測技術而言，已經(jīng)比較成熟，正常情況下檢測數(shù)據(jù)需3～4周出報告。高通量測序的數(shù)據(jù)分析能力較前也有了很大的提高，美國貝勒醫(yī)學院在WES應用于臨床的前半年，1例患者需要40～50 h，也就是1個人1周完成1個病例。半年后總結并形成了系統(tǒng)的分析流程，分析時間縮減到了1例患者需2 h。目前美國貝勒醫(yī)學院比較熟練的基因組分析員，分析1例患者約需1 h。

在數(shù)據(jù)分析中，前半部分屬于生物信息分析，在各個基因組檢測中心都做得比較好，多可以自動化形成分析流程，可以準確地過濾變異；后半部分屬于醫(yī)療信息分析，需要從檢測到的變異中篩選出可能的致病突變，這個過程非常依賴醫(yī)學相關的背景。其實現(xiàn)在缺乏的是能夠將生物信息分析和醫(yī)療信息分析進行協(xié)調，并有能力從各個數(shù)據(jù)庫遴選出有用的信息，在不同的分析階段，進行不同程度的側重注釋。這是目前影響WES數(shù)據(jù)分析流程的瓶頸。

周文浩教授 在新生兒多發(fā)畸形WES的數(shù)據(jù)分析中，檢測到的可能致病突變所在基因，其引起的疾病與患兒表型并不完全一致，您對“genotype first”還是“phenotype first”怎么看？

夏 凡教授 目前對人類基因組還有太多的不認識，分子遺傳學還有太多待解的謎題。現(xiàn)在之所以被困擾在“genotype first”還是“phenotype first”，其實主要還是因為對其不了解。被定義的單基因疾病，很多有非常高的異質性，即便是相同的突變位點、即便在一個家庭里，相同疾病的表型都不一致。是什么原因所致？這些疾病真的都是單基因疾病嗎？所幸的是，現(xiàn)在有這么多組學水平的技術手段：基因組學、甲基化組學、轉錄組學、蛋白組學等，能以一種前所未有的速度來解讀人類遺傳物質。隨著研究的深入，可能會顛覆很多現(xiàn)在認為正確的觀念，也一定會解決現(xiàn)在這些疑問。

新生兒多發(fā)畸形WES的判讀是困難的，一是新生兒很多表型還沒有出現(xiàn)，或者并不典型，二是一部分新生兒多發(fā)畸形由于病情嚴重而不能存活，致使表型沒有得到診斷，不能被統(tǒng)計到常見表型中。2014年美國貝勒醫(yī)學院發(fā)表在JAMA上的文章，患者平均檢測年齡是6歲，隨著年齡的增長表型會更加明顯。但是，恰恰新生兒多發(fā)畸形最需要得到早診斷、早干預。

周文浩教授 目前國際上各個基因組檢測中心，陽性率25%～30%，余下的70%～75%有什么可做的嗎？

夏 凡教授 WES相當于一個篩選的方法，在人類全部22 000個基因中，目前已經(jīng)認識的致病基因有3 000～5 000個，還有很多致病基因并不認識。2013年美國貝勒醫(yī)學院對250例先證者進行WES臨床檢測，陽性率為25%，現(xiàn)在診斷率已經(jīng)上升至28%，剩余的70%～75%的病例繼續(xù)采用模式生物的結果等做進一步分析，可能還會發(fā)現(xiàn)一些候選基因有研究價值。

4年前，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)在孟德爾遺傳學中心開始對家系進行WES檢測。最近，NIH又在進行確診疾病網(wǎng)項目，希望能在罕見疾病的病因研究中有所發(fā)現(xiàn)。

此外，目前所采用的分析方法，主要關注的是單基因疾病。那么，還有雙基因、三基因甚至多基因疾病，如GJB2/GJB6，當2個基因都含有雜合致病突變時才會致病。各個研究機構正在進行雙基因乃至多基因模式的研究，有所突破是就是世界領先的水平。

致謝 感謝復旦大學附屬兒科醫(yī)院楊琳博士承擔本文的錄音整理工作。

(本文編輯：張崇凡)

復旦大學附屬兒科醫(yī)院2015年國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目(一)

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.001

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關項目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學領域重點項目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計委項目：滬衛(wèi)計科教〔2013〕018號

夏凡 美國貝勒醫(yī)學院； 周文浩，王慧君 上海市出生缺陷防治重點實驗室，復旦大學兒童發(fā)育與疾病轉化醫(yī)學研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點實驗室，復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102

周文浩，E-mail：zwhchfu@126.com

2014-12-20

2015-01-18)