李素芳，陳 紅，任景怡，李晶津，宋俊賢，耿 強(qiáng)

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不穩(wěn)定冠心病循環(huán)microRNA表達(dá)譜特點(diǎn)及功能分析

李素芳，陳 紅*，任景怡，李晶津，宋俊賢，耿 強(qiáng)

（北京大學(xué)人民醫(yī)院心臟中心，北京 100044）

明確不穩(wěn)定冠心病患者循環(huán)microRNA（miRNA）表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)miRNA在細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用進(jìn)行探討。（1）分別收集不穩(wěn)定冠心病患者（試驗(yàn)組）及疑似心絞痛的非冠心病患者（對(duì)照組）血漿，通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)，得到試驗(yàn)組患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜。（2）分別在3個(gè)不同的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)——TargetScan、miRanda和DIANAmT，對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均有預(yù)測(cè)的miRNA靶基因。（3）通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)上述靶基因在細(xì)胞增殖方面的功能進(jìn)行聚類及信號(hào)通路分析。（4）通過(guò)實(shí)時(shí)（real time，RT）-PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證循環(huán)miRNA-19b（miR-19b）在兩組中的表達(dá)水平。（5）結(jié)合功能聚類分析結(jié)果，對(duì)差異表達(dá)最明顯的（miR-19b）在細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。（1）與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組存在39個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中miR-19b差異表達(dá)最明顯。（2）通過(guò)對(duì)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有14個(gè)miRNAs與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，其中miR-19b調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)基因最多。（3）RT-PCR檢測(cè)證實(shí)不穩(wěn)定冠心病患者血漿miR-19b水平較對(duì)照組明顯增高。（4）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，miR-19b明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926細(xì)胞）增殖。不穩(wěn)定冠心病患者具有特定的循環(huán)miRNA表達(dá)譜，這些miRNAs可能是不穩(wěn)定冠心病的潛在生物標(biāo)志物。miR-19b可能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，發(fā)揮穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的保護(hù)作用。

冠心病；微小RNAs；細(xì)胞增殖

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類在進(jìn)化上高度保守的單鏈、非編碼小分子RNA[～22nt]，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)1000多個(gè)miRNAs，約30%的人類蛋白編碼基因受到miRNAs的調(diào)控[1,2]。miRNA參與調(diào)節(jié)體內(nèi)許多生理和病理過(guò)程，與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的發(fā)病或預(yù)后密切相關(guān)。早在2008年有關(guān)腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNAs廣泛存在于血液循環(huán)中[3]。而且在不同的疾病狀態(tài)或病理刺激下，循環(huán)miRNAs表達(dá)譜存在差異，因而可能成為一類新的診斷疾病的生物標(biāo)志物。急性冠脈綜合征主要包括不穩(wěn)定冠心病（unstable coronary heart disease，UCHD）、急性心肌梗死、心源性猝死3大類。其中有關(guān)急性心肌梗死的miRNA標(biāo)志物已有大量研究和報(bào)道，心肌特異表達(dá)或高表達(dá)的miRNAs——miR-1、miR-133、miR-208a、miR-499，可能是優(yōu)于肌鈣蛋白的診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)志物[4?11]。然而，目前有關(guān)UCHD的循環(huán)miRNA標(biāo)志物的研究相對(duì)較少[12]，其確診主要依據(jù)患者的臨床癥狀及冠狀動(dòng)脈造影檢查。因此，本研究收集人民醫(yī)院心內(nèi)科UCHD患者及以胸痛收入院的非CHD患者的血漿，對(duì)UCHD的循環(huán)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行篩選，借助生物信息學(xué)分析差異表達(dá)miRNA的潛在生物學(xué)作用，并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA的作用進(jìn)行驗(yàn)證。

1 對(duì)象與方法

1.1 入選與排除標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)組入選標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)滿足（1）參照2011年美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)（AHA）不穩(wěn)定冠心病診療指南[13]；（2）冠脈造影證實(shí)存在動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)滿足（1）冠脈造影陰性；（2）平板運(yùn)動(dòng)陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心肌損傷標(biāo)志物升高；（2）心肌炎、心源性休克；（3）嚴(yán)重肝腎功能異常病史；（4）惡性腫瘤；（5）自身免疫性疾病；（6）血液系統(tǒng)疾?。唬?）急性炎癥性疾病。

1.2 血漿標(biāo)本的收集

冠狀動(dòng)脈造影前，留取患者血液至依地酸（EDTA）抗凝管。血液標(biāo)本經(jīng)過(guò)1000轉(zhuǎn)/min、4℃、離心10min，得到上層液體即為血漿，分裝后-70℃凍存。

1.3 循環(huán)miRNA的提取

采用miRNA提取試劑盒（miRNeasy kit，Qiagen公司），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取[14]。

1.4 miRNA芯片

采用TLDA（TaqMan low-density array）低密度芯片（TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0，ABI公司））進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)。使用Data Assist軟件（TaqMan gene expression assays version 2.0）對(duì)芯片原始Ct值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 差異表達(dá)miRNA篩選

使用微矩陣顯著性分析（Significant Analysis of Microarray，SAM）軟件包篩選差異表達(dá)的miRNA，通過(guò)設(shè)置錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）值＜0.0001%，差異倍數(shù)值（fold change）＞1.5，得到組間表達(dá)差異的miRNA。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過(guò)生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具——TargetScan、miRanda和DIANAmT，分析差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因，將以上三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到的靶基因取交集，得到共同預(yù)測(cè)出的靶基因。然后利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，分析這些miRNA潛在靶基因的生物學(xué)功能及介導(dǎo)這些功能的信號(hào)通路。

1.7 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

采用TaqMan MicroRNA遞轉(zhuǎn)錄試劑盒和帶頸環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA特異性探針（ABI公司，美國(guó)）進(jìn)行（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR），實(shí)驗(yàn)流程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取血漿miRNA時(shí)，外源性加入化學(xué)合成的秀麗隱桿線蟲(chóng)[miRNA-39（miR-39），cel-miR-39，Qiagen公司，美國(guó)]，10mol/樣本，作為PCR的內(nèi)參[15]。數(shù)據(jù)以2-△△CT表示。

1.8 細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)（CCK8實(shí)驗(yàn)）

利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)）將miRNA mimic（ABI公司，美國(guó)）轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細(xì)胞（培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱），24h后加入cell細(xì)胞計(jì)數(shù)盒2（counting kit2，CCK8）試劑繼續(xù)孵育1h，檢測(cè)樣本在490nm波長(zhǎng)處的吸光值，反映細(xì)胞增殖情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。分類變量采用卡方檢驗(yàn)，連續(xù)變量采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群一般情況

共入選64名受試者，其中對(duì)照組32人表現(xiàn)為非心源性胸痛或胸悶，冠脈造影陰性。32人表現(xiàn)為典型UCHD，并由冠脈造影證實(shí)為CHD。研究人群的臨床基線資料見(jiàn)表1。

表1 研究人群基線資料

UCHD: unstable coronary heart disease; BMI: body mass index; WBC: white blood cell; ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate aminotransferase; LDL-C: low density lipoprotein cholesterol; ACEI: angiotensin-converting enzyme inhibitor; ARB: angiotensin receptor blocker. Allvalues represent comparisons between UCHD patients and controls. Comparisons between UCHD patients and controls were performed with Student’s-test for continuous variables and with chi-square test for categorical variables.

2.2 不穩(wěn)定冠心病患者循環(huán)miRNA差異表達(dá)譜

共進(jìn)行TaqMan miRNAs TLDA低密度芯片（A＋B板）篩查實(shí)驗(yàn)24例（其中試驗(yàn)組12例，對(duì)照組12例）。經(jīng)SAM軟件分析，設(shè)置FDR值為＜0.0001%，差異倍數(shù)＞1.5，得到組間差異表達(dá)的miRNAs共39個(gè)，其中miR-19b差異表達(dá)最明顯（表2）。

表2 不穩(wěn)定冠心病患者39個(gè)差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs

UCHD: unstable coronary heart disease. Circulating miRNAs show signi?cant change in UCHD patients (＝12) compared with controls (＝12). Only miRNAs with more than 1.5-fold change and false discovery rate ＜0.0001% are shown here

2.3 差異表達(dá)miRNA參與細(xì)胞增殖的調(diào)控

將39個(gè)miRNA分別輸入miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)——TargetScan、miRanda和DIANAmT，得到各個(gè)miRNA的潛在靶基因，將預(yù)測(cè)結(jié)果取交集，得到在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均有預(yù)測(cè)的靶基因及其相應(yīng)的miRNA。因?yàn)檠芗?xì)胞增殖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的一個(gè)重要病理過(guò)程，故在本研究中，我們分析了細(xì)胞增殖相關(guān)的miRNA及其靶基因。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示39個(gè)miRNA中，有14個(gè)miRNA調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，而且受miR-19b調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)基因數(shù)目最多（圖1）。將這些增殖相關(guān)靶基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，得到14個(gè)miRNA參與調(diào)控的主要信號(hào)通路（圖2）。

2.4 miR-19b抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖

冠心病患者血管內(nèi)皮激活后，細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，最終導(dǎo)致血管新生，不利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的維持。首先，我們通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)，在另外一組人群中（試驗(yàn)組20人，對(duì)照組20人）檢測(cè)了血漿中miR-19b水平，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)一致，即試驗(yàn)組患者循環(huán)miR-19b水平較對(duì)照組明顯增高，約為對(duì)照組的3.65倍（＜0.01，圖3A）。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19b對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用，通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組（NC mimic）相比，轉(zhuǎn)染miR-19b mimic組（終濃度30nmol/L）的內(nèi)皮細(xì)胞增殖受到明顯抑制（約抑制40%，＜0.001，圖3B）。

3 討 論

本研究通過(guò)miRNAs芯片篩查，發(fā)現(xiàn)一組UCHD患者特異性的循環(huán)miRNAs表達(dá)譜（包括miR-19b在內(nèi)的一共39個(gè)miRNAs），與非心源性胸痛患者的循環(huán)miRNAs表達(dá)譜存在顯著差異。通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs在抑制細(xì)胞增殖中發(fā)揮潛在的調(diào)控作用。最后以差異表達(dá)最明顯的miR-19b為研究對(duì)象，證明miR-19b具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。

Hoekstra等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定型心絞痛相比，UCHD患者外周血單核細(xì)胞中的miR-198、miR-134、miR-370水平均明顯升高。而本研究以血漿循環(huán)miRNA為檢測(cè)目標(biāo)，避免了從血液分離單核細(xì)胞的過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間，有利于將來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化。在UCHD患者顯著上調(diào)的循環(huán)miRNAs中，并未包含既往文獻(xiàn)報(bào)道的心肌特異或高表達(dá)的miRNAs（如miR-1、miR-133、miR-208a、miR-499等）[4?11]，提示這種差異表達(dá)循環(huán)miRNAs水平的變化出現(xiàn)在心肌損傷之前，因而具有早期預(yù)警的價(jià)值。此外，我們所發(fā)現(xiàn)的UCHD患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜與2014年Zeller等[15]的研究結(jié)果相比，兩項(xiàng)研究所發(fā)現(xiàn)的部分差異表達(dá)miRNA是一致的，他們的研究包含了在UCHD患者中循環(huán)miR-19b的上調(diào)，這有助于證明miR-19b與UCHD的相關(guān)性。

近期研究認(rèn)為循環(huán)miRNAs不僅可以作為診斷疾病的標(biāo)志物，而且可能在疾病狀態(tài)下發(fā)揮重要的調(diào)控作用。幾項(xiàng)重要研究結(jié)果均提示，循環(huán)miRNAs可以通過(guò)微顆粒、外泌體或者脂蛋白介導(dǎo)的方式在細(xì)胞與細(xì)胞之間發(fā)揮通訊媒介的作用，從而以自分泌/旁分泌的方式進(jìn)入靶細(xì)胞并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[17,18]。內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理性改變，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及形成新生血管，非常不利于斑塊的穩(wěn)定性。miRNA作為機(jī)體重要的調(diào)節(jié)分子，可能在斑塊破裂前已經(jīng)發(fā)揮了保護(hù)作用。因此，本研究還進(jìn)一步具體分析了差異表達(dá)的miRNA靶基因，重點(diǎn)關(guān)注miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，39個(gè)差異表達(dá)的miRNAs中，有14個(gè)miRNA的靶基因與細(xì)胞增殖相關(guān)。上調(diào)最明顯的miR-19b的增殖相關(guān)靶基因數(shù)目最多，其影響細(xì)胞增殖的信號(hào)通路有常見(jiàn)的TGF-β信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。最后，我們對(duì)miR-19b的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-19b的內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程被明顯抑制。

圖1 在細(xì)胞增殖過(guò)程中具有潛在調(diào)控作用的miRNAs

Figure 1 The miRNAs potentially regulating cell proliferation

圖2 介導(dǎo)miRNA發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖作用的信號(hào)通路

Figure 2 Signaling pathway mediating the regulating role of miRNA on cell proliferation

圖3 不穩(wěn)定冠心病患者血漿miR-19b水平和miR-19b對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用

Figure 3 The miR-19b levels in plasma from UCHD patients (A) and inhibitory effects of miR-19b on the proliferation of endothelial cells (B)

Con: control group; UCHD: unstable coronary heart disease group; CCK8: cell counting kit 8. A: Real-time PCR analysis of the miR-19b levels in plasma from UCHD patients (=20). Compared with control group (=20),**＜0.01. MiRNAs levels were normalized to the spiked-in cel-miR-39. B: The inhibitory role of miR-19b on endothelial proliferation. Compared with NC mimic,***＜0.001 (=3)

本研究尚存在一些局限性，從生物標(biāo)志物研究看，樣本量偏小，且為橫斷面研究，因而距離臨床的應(yīng)用和推廣尚有很長(zhǎng)的一段距離[19]；從miRNA作用機(jī)制研究看，僅初步探討了miR-19b對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)作用，未來(lái)需要借助動(dòng)物模型進(jìn)一步探討miR-19b對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響。

總之，本研究的結(jié)果提示，UCHD患者發(fā)生心肌梗死前，機(jī)體已經(jīng)通過(guò)miRNA啟動(dòng)保護(hù)程序，從而延緩甚至避免疾病的進(jìn)一步發(fā)展、惡化。我們的研究不僅為UCHD的診斷提供了潛在標(biāo)志物，而且為避免惡性冠脈事件的發(fā)生提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

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（編輯: 李菁竹）

Expression profiles and functional analysis of circulating microRNAs in unstable coronary heart disease

LI Su-Fang, CHEN Hong*, REN Jing-Yi, LI Jing-Jin, SONG Jun-Xian, GENG Qiang

(Heart Center, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China)

To determine the expression profile of microRNAs (miRNAs) in the patients with unstable coronary heart disease and investigate the regulation role of differential expressed miRNAs in cell proliferation.(1) After the plasma samples of patients with confirmed unstable coronary heart disease and non-coronary heart disease with suspected angina (control) were collected, miRNAs array was employed to identify distinct miRNA expression profiles. (2) The potential target genes of the above miRNAs were predicted by 3 miRNA target prediction algorithms, TargetScan, miRanda and DIANAmT. (3) The genes predicted by the three algorithms were further analyzed for their regulation roles in cell proliferation and involed signaling pathways by DAVID database. (4) Real-time PCR were used to test plasma miR-19b levels in patients with unstable coronary heart disease compared with the controls. (5) Based on the results of function cluster analysis, the effect of the most differentially expressed miR-19b was detected on the regulation of cell proliferation.(1) Compared with the controls, there were 39 differentially expressed miRNAs, and miR-19b was the most obviously one. (2) By analyzing the target genes of the differential expressed miRNAs, there were 14 miRNAs closely related with cell proliferation, and miR-19b was the closest one. (3) Real-time PCR confirmed that the plasma miR-19b level was obviously higher in the patients with unstable coronary heart disease than in the controls. (4) The results of CCK-8 assay showed that miR-19b indeed inhibited the proliferation in EA.hy926 cells.There is a specific expression profile of circulating miRNAs in the patients with unstable coronary artery disease. The differentially expressed miRNAs may be the biomarkers of unstable coronary heart disease. MiR-19b may play a protective role in the stability of atherosclerotic plaque by inhibiting the proliferation of endothelial cells.

coronary heart disease; microRNAs; cell proliferation

R541.4; R342.3

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.03.045

2014?12?02;

2014?12?18

國(guó)家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目（2012ZX09303019）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81470473，81270274）；北京市自然科學(xué)基金（7132225，7122198）

陳 紅, E-mail: chenhongbj@medmail.com.cn

(2012ZX09303019),(81470473, 81270274),(7132225, 7122198).