高富紅，高艷艷，周德剛

（國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)高新區(qū)惠中獸藥471003）

復(fù)方中藥由淫羊藿、黃芪、女貞子、甘草等多種成分組成，方中淫羊藿具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管系統(tǒng)等功能；黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、利水消腫等作用，并能使動(dòng)物脾內(nèi)漿細(xì)胞增生，促進(jìn)抗體合成，對(duì)體液免疫功能有促進(jìn)作用；女貞子具有提高機(jī)體抗體水平的作用；甘草具有補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥的功能。然而復(fù)方中藥是否也對(duì)機(jī)體免疫功能造成影響尚未證實(shí)，本研究探討了復(fù)方中藥對(duì)小鼠多項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響，旨在全面了解其對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 健康未交配的昆明種小鼠，體重20±2g，雌雄各半，購(gòu)自河南省康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SLXK（豫）2011-0001。試驗(yàn)前觀察一周，滅菌全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，飲用消毒處理的自來(lái)水，室溫20～24℃，相對(duì)濕度40～60%。挑選健康活潑的小鼠100只（雌雄各半）用于試驗(yàn)。

儀器：XF9080A動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；電子天平，型號(hào)：JA2003，上海上平儀器廠；離心機(jī)TGL-16G，金壇市科興儀器廠。

試劑：復(fù)方中藥：國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心中藥所提供，批號(hào)：20120901；環(huán)磷酰胺(CY)：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：12030725；綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液：由健康綿羊頸靜脈取血，以0.9%氯化鈉液洗滌3次后配成所需濃度；補(bǔ)體：采集豚鼠血液，離心，分離血清，用生理鹽水配成10%，即為補(bǔ)體（1：10），批號(hào)為20120905。都氏試劑：碳酸氫納1.0g，氰化鉀0.05g，高鐵氰化鉀0.2g，加蒸餾水至1000m l，所用試劑均為市售分析純，購(gòu)自萊陽(yáng)市雙雙化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及給藥方法 取昆明種小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為正常組(A組)、模型組(B組)，復(fù)方中藥低(C組)、中(D組)、高劑量組(E組)。各組給藥方法如下：

正常組（A組）：生理鹽水25m1·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)10d，于給藥第7天起給予生理鹽水腹腔注射10m1·kg-1·d-1，連續(xù)3d。

模型組（B組）:生理鹽水25m1·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)10d，于給藥第7天起給予環(huán)磷酰胺腹腔注射10m1·kg-1·d-1，即50mg·kg-1·d-1，連續(xù)3d，制造小鼠免疫抑制模型[1]。藥物(復(fù)方中藥低、中、高劑量)組（C、D、E組）：復(fù)方中藥劑量分別為8.5g·kg-1·d-1、17g·kg-1·d-1、34g·kg-1·d-1，即25.5g生藥·kg-1·d-1、51g生藥·kg-1·d-1、102g生藥·kg-1·d-1，連續(xù)10d。于給藥第7天起給予環(huán)磷酸胺，劑量用法同模型組。

1.2.2 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 上述各組動(dòng)物于末次給藥結(jié)束后24h，摘除眼球采血，用血細(xì)胞分析儀測(cè)定外周血白細(xì)胞。

1.2.3 小鼠免疫器官臟器指數(shù)檢測(cè)[2]上述各組動(dòng)物于末次給藥結(jié)束后24h采血后脫臼處死，小心取出完整胸腺，并分離脾臟，去掉筋膜及脂肪組織，用電子天平稱胸腺、脾臟重，并計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。以脾臟和胸腺的重量指數(shù)mg/10g（體重）表示，比較組間差異。計(jì)算公式如下：胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)=胸腺或脾臟重量(mg)×10/體重(g)。

1.2.4 對(duì)小鼠血清溶血素生成的影響[3]另取小鼠50只進(jìn)行試驗(yàn)，小鼠分組同1.2.1，先灌胃給藥，連續(xù)10d。給藥第5天小鼠腹腔注射5%綿羊紅細(xì)胞0.1m1/l0g進(jìn)行免疫并繼續(xù)給藥。給藥第7天起，除正常對(duì)照組外，其余各組給予環(huán)磷酰胺灌胃50mg/kg造成免疫功能低下，連續(xù)3d。于灌胃給藥第11天小鼠眼眶取血，分離血清，用生理氯化鈉溶液稀釋100倍。取稀釋血清1m1，加5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.5m l，10%補(bǔ)體0.5m l?？瞻坠苡玫攘可睇}水代替血清，混勻，在37℃恒溫箱中保溫30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)。3000r/min離心10min，取上清液1ml加都氏試劑3ml，搖勻放置10min，于540 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。依公式計(jì)算血清半數(shù)溶血值：樣品HC50=樣品的吸光度值×稀釋倍數(shù)／SRBC半數(shù)溶血值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所測(cè)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并用分析軟件SPSS11.0分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)的影響 從測(cè)定結(jié)果可以看出，與正常組相比，環(huán)磷酰胺模型組外周血白細(xì)胞數(shù)降低，呈顯著性差異。與環(huán)磷酰胺組模型相比，復(fù)方中藥各劑量組外周血白細(xì)胞數(shù)均有所升高，呈顯著性差異。并且復(fù)方中藥各劑量組間差異不顯著。說(shuō)明復(fù)方中藥可以使環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠外周血白細(xì)胞升高。結(jié)果見(jiàn)表1：比較P<0.01。

表1 對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)的影響（x±s）

2.2 對(duì)免疫器官臟器指數(shù)的影響 與正常組比較，環(huán)磷酰胺模型組胸腺、脾臟免疫器官臟器指數(shù)均降低，呈顯著性差異，說(shuō)明環(huán)磷酰胺模型組小鼠免疫功能低下。與環(huán)磷酰胺模型組相比，復(fù)方中藥除低劑量組脾臟指數(shù)稍有降低外，其余各劑量組免疫器官臟器指數(shù)均有所升高，其中低劑量組差異不顯著，中、高劑量組呈顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表2：

表2 對(duì)免疫器官臟器指數(shù)的影響（x±s）

2.3 對(duì)血清溶血素生成的影響 環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫功能低下后，復(fù)方中藥各劑量組均能促進(jìn)小鼠血清溶血素的生成，隨著復(fù)方中藥劑量的增加，對(duì)小鼠血清溶血素的生成影響越顯著。并且與環(huán)磷酰胺組相比，低劑量組差異不顯著，中、高劑量組呈顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表3：

表3 對(duì)血清溶血素生成的影響（x±s）

3 討論

機(jī)體的免疫由特異性免疫和非特異性免疫所組成[4]。非特異性免疫是特異性免疫的基礎(chǔ)，特異性免疫所產(chǎn)生的免疫物質(zhì)又能增強(qiáng)非特異性免疫的作用，因此，在研究中至少觀察體液免疫及細(xì)胞免疫功能各一種，才能初步肯定該藥物對(duì)免疫功能的作用[3]。

白細(xì)胞具有吞噬異物、衰老死亡的細(xì)胞、病原微生物和抗原抗體復(fù)合物的功能，調(diào)節(jié)機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方中藥各劑量組與環(huán)磷酰胺組相比，外周血白細(xì)胞數(shù)均有所升高，呈顯著性差異。說(shuō)明復(fù)方中藥可以調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的非特異性免疫應(yīng)答，提高其免疫功能。

免疫器官相對(duì)質(zhì)量的變化在免疫評(píng)價(jià)中占有重要地位，如研究結(jié)果與其它免疫指標(biāo)一致，則該結(jié)果更為可靠，常供藥物初篩實(shí)驗(yàn)時(shí)用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，復(fù)方中藥中、高劑量組均能提升環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫器官指數(shù)。

小鼠血清溶血素水平是一項(xiàng)機(jī)體特異性免疫功能的主要指標(biāo)[5-6]，檢測(cè)致敏動(dòng)物血清中溶血素的含量，可以反映藥物對(duì)體液免疫的影響[7]。它反映了B細(xì)胞的增殖以及和補(bǔ)體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力[8]。實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)方中藥中、高劑量組均能提升環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的血清溶血素水平。

4 結(jié)論

復(fù)方中藥中、高劑量組能顯著提高環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)，提高其免疫器官指數(shù)及血清溶血素水平，說(shuō)明復(fù)方中藥對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的增強(qiáng)作用，是一種良好的免疫增強(qiáng)劑。

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