王王志志偉偉 王王志志剛剛 鄧鄧翠翠芬芬

（1 鄭州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 鄭州 450052；2 河南省睢縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所河南睢縣476900；3 福建省寧德縣貝迪動物藥品廠福建寧德352100）

香附輔以穿心蓮、黃芪，以中藥藥性理論為基礎(chǔ)，遵循“君臣佐使”配伍規(guī)律[1]組合而成香蓮芪組方。香附具有理氣解郁[2]和解熱鎮(zhèn)痛作用[3]，穿心蓮具有清熱、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[4]，黃芪具有利尿降壓、抗炎、強心及提高機體免疫[5]之功效，該組方對大腸桿菌有較好的抗菌活性[6]。用臨床分離鑒定的O2型大腸桿菌建立雞大腸桿菌病疾病模型，分別進行預防試驗和治療試驗，旨在觀察香蓮芪中藥制劑的體內(nèi)抗菌活性，為該復方制劑的臨床應用提供一些實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

香附(R hizom a cyperi)、穿心蓮(A ndrographis panniculata)和黃芪(A stragalus m em branaceus)；注射用乳酸環(huán)丙沙星，為山東某藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；0.5% 石碳酸、生理鹽水均由實驗室配制。

1.1.2 菌種

O2型雞源性大腸桿菌，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離保存和鑒定。

1.1.3 培養(yǎng)基

EC 營養(yǎng)肉湯，為山東某公司產(chǎn)品，批號：20140608；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，為山東某公司產(chǎn)品，批號：20140603；營養(yǎng)瓊脂，為杭州某公司產(chǎn)品，批號20140616。

1.1.4 試驗動物

健康1 日齡京白939 蛋公雛，由河南某經(jīng)營公司種雞場提供。

1.1.5 儀器

D H G-9245A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，北京恒泰豐科試驗設(shè)備有限公司；FA 1004N 電子天平，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；G H P-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，深圳市愛特爾電子科技有限公司；SW -CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，常州杰博森儀器有限公司；Y H-350Z 型全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥制劑的制備

按照方劑配伍組成準確稱取香附40g、穿心蓮20g 和黃芪30g，首次加10 倍蒸餾水浸泡lh 后，文火煎煮40m in，第2 次加8 倍量水，文火煎煮30m in，第3 次加6 倍量水，文火煎煮20m in,每次煎煮完后用8 層紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1g生藥/m L 的濃度。121℃高壓滅菌15m in。4℃冰箱保存。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

按照培養(yǎng)基使用說明配制，121℃高壓滅菌15 m in，液體培養(yǎng)基冷卻后，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫腆w培養(yǎng)基溫度降到55℃左右時澆平板。

1.2.3 菌懸液的配制

采用活菌計數(shù)法[7]，以獲得原菌液中細菌的個數(shù)為2×1012cfu/m L。

1.2.4 雞大腸桿菌病疾病模型的建立

隨機挑選30 只16 日齡雛雞，按0.8 m L/只雞腹腔注射2×108cfu/m L 菌液，觀察雞群癥狀及動物死亡情況，篩選出最佳染菌濃度，以受試動物感染細菌的最小致死量或80% 以上感染動物出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀作為最佳感染量[8]。經(jīng)臨床癥狀、病理剖檢、顯微觀察及劃線接種麥康凱瓊脂平板，菌落呈紅色[9-10]。即可初步診斷為雞大腸桿菌病。

1.2.5 預防試驗

隨機選取16 日齡雛雞200 只，分成5 組，每組40 只，其中4 組按照1.2.4 的方法染菌，另外1 組不染菌。染菌的4 組分別口服1 m L 生理鹽水（對照組）、0.5 m L（低劑量組）、1 m L（中劑量組）和2 m L（高劑量組）的藥劑，連用10 d，1 次/天，再觀察2 周，觀察和記錄動物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。計算發(fā)病率、死亡率和保護率[8]。

發(fā)病率=發(fā)病動物數(shù)/試驗動物數(shù)×100%

死亡率=死亡動物數(shù)/試驗動物數(shù)×100%

保護率=未發(fā)病的動物數(shù)/試驗動物數(shù)×100%

1.2.6 治療試驗

按照1.2.4 的方法染菌，待表現(xiàn)明顯癥狀時，隨機分成5 組，每組40 只，1 組皮下注射乳酸環(huán)丙沙星（按體重5 m g/kg）作為陽性對照組；1 組口服1 m L 生理鹽水（陽性對照組）；另外3 組分別口服香蓮芪中藥制劑1 m L（低劑量組）、2 m L（中劑量組）和4 m L（高劑量組），連用10 d，2 次/天，再觀察2 周，觀察和記錄動物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。計算死亡率、有效率和治愈率[8]。

有效率=癥狀好轉(zhuǎn)動物數(shù)/發(fā)病動物數(shù)×100%

治愈率=癥狀消失動物數(shù)/發(fā)病動物數(shù)×100%

1.2.7 試驗動物飼養(yǎng)

飼養(yǎng)管理按《蛋雞飼養(yǎng)技術(shù)手冊（第二版）》進行。分層籠養(yǎng)，暖氣供熱，24 h 光照，自由采食和飲水。試驗日糧為蛋雛雞配合飼料，由北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司提供。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用x±SD 表示，數(shù)據(jù)間差異的顯著性采用SPSS 13.0 軟件多重比較完成檢驗，有極顯著性差異P＜0.01，有顯著性差異P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蓮芪中藥制劑可以降低人工感染雛雞大腸桿菌病的發(fā)病率

如表1 所示，試驗雞于16 日齡腹腔注射大腸桿菌，同時口服1.0g/m L 香蓮芪中藥制劑的0.5m L、1.0 m L、2.0 m L 3 個 劑 量3d、10 d 及停藥2 周后，試驗動物的發(fā)病率在19 日齡時與感染對照組相比，給藥組均有極顯著差異(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組之間也有極顯著的增強(P＜0.01)，由此提示，香蓮芪中藥制劑能夠顯著地預防人工感染大腸桿菌?。坏?6 日齡直至試驗結(jié)束時，香蓮芪中藥制劑低、中、高劑量組均極顯著低于對照組(P＜0.01)，說明口服香蓮芪中藥制劑，能明顯提高試驗雞抵抗大腸桿菌的感染。而19 日齡時與中、高劑量組相比，差異不顯著(P＞0.05)，而與低劑量組差異均極顯著(P＜0.01)，建議臨床添加1.0m L 香蓮芪中藥制劑，可提高雛雞抗大腸桿菌病的能力。

2.2 香蓮芪中藥制劑對人工感染雛雞大腸桿菌病的保護率和死亡率

如表2 所示，口服香蓮芪中藥制劑后，可以調(diào)動雛雞機體的防御體系，提高雛雞大腸桿菌病的保護率，降低其死亡率。香蓮芪中藥制劑中、高劑量對雞大腸桿菌病的保護率均超過85% ，死亡率低于5% ，與感染對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。在保護率方面，中、高劑量組與低劑量組有極顯著性差異（P＜0.01）；在死亡率方面，中、高劑量組與低劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；而中、高劑量組之間無顯著性差異。故建議臨床口服1.0 m L 香蓮芪中藥制劑，可提高雛雞抗病能力、降低死亡率。

表2 香蓮芪中藥制劑預防雞大腸桿菌病的保護率和死亡率（%）

2.3 香蓮芪中藥制劑治療人工感染雛雞大腸桿菌病的效果

如表3 所示，香蓮芪中藥制劑可以降低感染雛雞死亡率，與乳酸環(huán)丙沙星陽性對照組有顯著性差異(P＜0.05)，極顯著低于感染對照組(P＜0.01)。其治愈率與陽性對照組相比也有極顯著性差異(P＜0.01)，高劑量香蓮芪中藥制劑治療雞大腸桿菌病的有效率顯著高于陽性對照組(P＜0.05)。由此提示，香蓮芪中藥制劑能有效治療大腸桿菌急性感染，劑量效應關(guān)系顯示，對發(fā)病期動物可以適當加大給藥頻率以達到較高的藥物濃度，進而達到治愈疾病的目的。

3 討論

3.1 雛雞大腸桿菌病病理模型的建立

利用動物疾病模型研究藥物抗病活性是目前常用的研究方法，然而疾病模型的建立與試驗動物種系、年齡、病原類別、濃度、攻毒劑量和頻率等因素密切相關(guān)。

3.2 香蓮芪中藥制劑對人工感染雞大腸桿菌病的預防

給雛雞攻毒同時給予香蓮芪中藥制劑后，雖然香蓮芪中藥制劑不同劑量組均有試驗動物發(fā)病，甚至死亡，但發(fā)病率、死亡率均極顯著低于感染組(P＜0.01)。染菌前3 天，中、高劑量組保護率達到85% 以上，高于史書軍等報道[11-12]，且給藥組發(fā)病動物僅在8～18 h 內(nèi)出現(xiàn)死亡，而隨著持續(xù)給藥，患病動物的癥狀也逐漸好轉(zhuǎn)，最終全部恢復正常，使保護率可達到100% 。由此充分展示了藥物發(fā)揮作用需要時間，且香蓮芪中藥制劑既可以直接殺滅病原，又可以通過提高機體免疫力發(fā)揮抗病作用。通過對死亡動物的剖檢發(fā)現(xiàn)，香蓮芪中藥制劑試驗動物肝臟有較輕微壞死灶，而感染組試驗動物肝臟出血、壞死明顯，說明香蓮芪中藥制劑可能有一定毒性；香蓮芪中藥制劑死亡試驗動物腹腔內(nèi)積聚了大量的炎性細胞，脾臟器官指數(shù)顯著大于感染組，這表明香蓮芪中藥制劑能夠調(diào)動機體免疫細胞，刺激脾淋巴細胞增殖，對抗大腸桿菌的入侵。

3.3 香蓮芪中藥制劑對人工感染雞大腸桿菌病的治療

對香蓮芪中藥制劑進行體外抑菌試驗其M IC 為0.25～1.0 g/m L，說明香蓮芪中藥制劑體外抑制大腸桿菌的活性并不高，所以在香蓮芪中藥制劑連續(xù)給藥的前2 天內(nèi)，發(fā)病動物死亡較多，隨著給藥時間的延長，香蓮芪中藥制劑增強了動物自體免疫防御系統(tǒng)，改善了動物生理機能，進而發(fā)揮抗病作用，中、高劑量組使病雞的死亡率控制在15% 以下，治愈率達到86.5% 以上，略高于王雙山等報道[13]；有效率達到93.8% 以上，與乳酸環(huán)丙沙星陽性對照組有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），而在體外抑菌試驗中乳酸環(huán)丙沙星顯示出明顯的抑菌效果。動物試驗結(jié)果說明，乳酸環(huán)丙沙星對人工感染雞大腸桿菌病的治療效果不如香蓮芪中藥制劑，這可能與香蓮芪中藥制劑能夠調(diào)動雛雞機體免疫力有關(guān)。

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表3 香蓮芪中藥制劑對雞大腸桿菌病理模型的治療效果（%）

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