向義和

清華大學(xué)物理系，北京 100084

DNA同源重組機(jī)制的確立

向義和?

清華大學(xué)物理系，北京 100084

介紹了DNA同源重組機(jī)制確立的過(guò)程。其主要內(nèi)容包括基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，交叉假設(shè)的提出，斷裂重接假設(shè)和復(fù)制選擇假設(shè)的出現(xiàn)，同源重組的三個(gè)模型(Holliday模型、單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型)的確立。

連鎖基因；同源重組；交叉假設(shè)；Holliday模型；單鏈斷裂模型；雙鏈斷裂模型

DNA重組(recombination)是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)部或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過(guò)程。同源重組(homologous recombination)是在兩個(gè)DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。進(jìn)行交換的同源序列可能是完全相同的，也可能是非常相近的。同源生物體通過(guò)重組可以產(chǎn)生新的基因或等位基因的組合，還可以提高種群內(nèi)遺傳物質(zhì)的多樣性，而人們可使用同源重組進(jìn)行遺傳作圖。

本文介紹了DNA同源重組機(jī)制確立的過(guò)程。20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)了基因連鎖和重組現(xiàn)象，在探討重組現(xiàn)象出現(xiàn)的原因時(shí)又提出了交叉假設(shè)，形成了交換概念。20世紀(jì)30年代中期在探討基因交換的機(jī)制時(shí)，出現(xiàn)了染色體交換的兩種假設(shè)：斷裂重接假設(shè)和復(fù)制選擇假設(shè)。1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家開(kāi)始在分子水平上探討同源重組的機(jī)制。20世紀(jì)60—80年代，科學(xué)家分別提出了DNA同源重組的三種模型：Holliday模型，單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型。

1 基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1.1 連鎖現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1905年，英國(guó)生物學(xué)家貝特森(Bateson W., 1851—1926)和龐尼特(Punnet R. C.)研究香豌豆兩對(duì)性狀的遺傳。他們選擇的一對(duì)性狀是花的顏色，有紫色和紅色兩種；另一對(duì)是花粉粒的形狀，有長(zhǎng)形和圓形兩種。將紫花長(zhǎng)花粉粒和紅花圓花粉粒的植株作親本進(jìn)行雜交，結(jié)果F1代都是紫花長(zhǎng)花粉粒，可見(jiàn)紫花對(duì)紅花是顯性，長(zhǎng)花粉粒對(duì)圓花粉粒是顯性。將F1代自交得到的F2代有紫長(zhǎng)、紫圓、紅長(zhǎng)、紅圓4種表型。這4種表型的比率不符合孟德?tīng)柕膬蓪?duì)遺傳因子的分離比9∶3∶3∶1，其中紫長(zhǎng)和紅圓的表型的比率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出9/16和1/16，而相應(yīng)的紫圓和紅長(zhǎng)的表型卻大大少于3/16(表1)。[1]

表1 香豌豆紫長(zhǎng)×紅圓雜交試驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與由孟德?tīng)栕杂山M合定律所預(yù)期結(jié)果相比較，F(xiàn)2代中性狀的親本組合類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于重組組合的類型。這等于說(shuō)，兩對(duì)基因在雜交子代中的組合并不是隨機(jī)的，在F1雜種形成配子時(shí)，原來(lái)屬于同一親本的兩個(gè)基因更傾向于進(jìn)入同一配子中，有更多保持親本原來(lái)組合的傾向，而且這種傾向與顯隱性無(wú)關(guān)。這是在自由組合定律方面第一次出現(xiàn)的顯著的例外，無(wú)疑，這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。

1.2 重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

1910年，美國(guó)遺傳學(xué)家摩爾根(Morgan T. H., 1866—1945)和他的學(xué)生布里吉斯(Bridges C. B., 1889—1938)用果蠅進(jìn)行了大量的雜交試驗(yàn)，研究了兩對(duì)基因的遺傳，發(fā)現(xiàn)了完全連鎖、不完全連鎖和重組現(xiàn)象[1]。

在黑腹果蠅中，灰體(B)對(duì)黑體(b)是顯性，長(zhǎng)翅(V)對(duì)殘翅(v)為顯性，這兩對(duì)基因在常染色體上。他們將灰體長(zhǎng)翅(BBVV)和黑體殘翅(bbvv)的果蠅雜交，F(xiàn)1代都是灰體長(zhǎng)翅(BbVv)。用F1的雜合體進(jìn)行下列兩種方式的測(cè)交，所得到的結(jié)果卻完全不同。①取F1雄蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雌蠅測(cè)交。按兩對(duì)基因的自由組合定律來(lái)預(yù)測(cè)，應(yīng)產(chǎn)生灰體長(zhǎng)翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長(zhǎng)翅(bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型的后代，且比率為1∶1∶1∶1?？墒菍?shí)驗(yàn)的結(jié)果并非如此，而是只有數(shù)目相同的灰體長(zhǎng)翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型。②如果用F1雌蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雄蠅測(cè)交，后代中就出現(xiàn)了灰體長(zhǎng)翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長(zhǎng)翅(bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型，但比率是0.42∶0.08∶0.08∶0.42。

摩爾根的解釋是：假定基因B和V同處于一條染色體上，基因b和v同處于同源染色體的另一條染色體上。他將這種處于同一條染色體上的基因遺傳時(shí)較多地聯(lián)系在一起的現(xiàn)象稱為連鎖(linkage)。對(duì)于上述第一種測(cè)交結(jié)果摩爾根稱為完全連鎖(complete linkage)(圖1)。

由于F1雜合雄蠅(BbVv)完全連鎖，即在同一染色體上的連鎖基因(如B、V基因或b、v基因)100%聯(lián)系在一起傳遞到下一代。因此只產(chǎn)生數(shù)目相等的兩種配子BV和bv，所以和黑體殘翅(bbvv)的雌蠅測(cè)交時(shí)，后代只能有數(shù)目相等的灰體長(zhǎng)翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型(圖1)。

第2種方式的測(cè)交，后代出現(xiàn)數(shù)目不等的4種表型，其中親本的類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于新類型。摩爾根稱這種連鎖為不完全連鎖 (incomplete linkage) (圖2)。不完全連鎖是指位于同一染色體上的2個(gè)或2個(gè)以上的等位基因，不總是作為一個(gè)整體傳遞到子代。

新類型是由于同源染色體上的不同對(duì)等位基因之間重新組合的結(jié)果，這種現(xiàn)象稱為重組(recombination)。在本項(xiàng)測(cè)交實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)的新類型共占16%，該數(shù)值表示基因Bb和Vv之間的重組值(recombination value)或重組頻率(recombination frequency, RF)。重組值用百分?jǐn)?shù)表示，其計(jì)算公式如下：

重組值(RF)=重組型數(shù)目/(親組型數(shù)目＋重組型數(shù)目)

重組值從0～50%變化。重組值的大小反映了個(gè)體在側(cè)交中同一條染色體上的基因的連鎖程度。重組值小，親組型基因的連鎖程度大，當(dāng)重組值是0時(shí)，為完全連鎖；重組值大，親組型基因的連鎖程度小，當(dāng)重組值達(dá)到50%，則4種配子成1∶1∶1∶1的比例，也就是自由組合了。

大量的實(shí)驗(yàn)資料表明，連鎖現(xiàn)象在生物界普遍存在。凡是位于同一條染色體上的基因群，均稱為一個(gè)連鎖群(linkage group)。摩爾根等在1914年已發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅有4個(gè)連鎖群，到1967年，在果蠅中至少測(cè)定了將近1 000個(gè)基因分別屬于這4個(gè)連鎖群。在遺傳學(xué)上，凡是充分研究過(guò)的生物中，連鎖群的數(shù)目都應(yīng)該等于單倍體染色體數(shù)(n)。

圖1 果蠅的完全連鎖

圖2 果蠅的不完全連鎖

2 交叉假設(shè)的提出和交換概念的證實(shí)

2.1 交叉假設(shè)的提出

在同一染色體上相互連鎖的基因?yàn)槭裁磿?huì)出現(xiàn)一定頻率的重組？換言之，在兩對(duì)基因連鎖遺傳時(shí)，形成親代所沒(méi)有的新組合的機(jī)制是什么?

在摩爾根等確立遺傳的染色體學(xué)說(shuō)之前，1909年比利時(shí)的細(xì)胞學(xué)家詹森斯(Janssens F. A.)在研究?jī)蓷惡椭背崮坷ハx(chóng)的減數(shù)分裂時(shí)，觀察到二價(jià)體(相互配對(duì)的兩條同源染色體，bivalent)的交叉，提出交叉型假設(shè)(chiasmatype hypothesis)，這是最早的重組理論。他認(rèn)為每次交叉都表明父、母本的一條染色單體接觸、斷裂和重接，形成一個(gè)新的組合，其他兩條染色單體仍保持完整狀態(tài)。因此每個(gè)交叉是重組行為可見(jiàn)的表現(xiàn)形式，其要點(diǎn)是：①生物在形成配子的過(guò)程中，都要經(jīng)減數(shù)分裂，在第一次減數(shù)分裂前期，兩個(gè)同源染色體配對(duì)，形成4條染色單體。配對(duì)中的同源染色體不是簡(jiǎn)單地平行靠攏，而是在非姊妹染色單體間的某些點(diǎn)上出現(xiàn)交叉纏結(jié)的圖像，每一個(gè)點(diǎn)上這樣的圖像稱為一個(gè)交叉(chiasma)，這是同源染色體間對(duì)應(yīng)片段發(fā)生過(guò)交換(crossing-over)的地方(圖3)。②處于同源染色體的不同座位的相互連鎖的兩個(gè)基因之間如果發(fā)生了交換，就導(dǎo)致這兩個(gè)連鎖基因的重組。

圖3 配對(duì)的同源染色體有兩個(gè)交叉，交叉結(jié)處表示非姊妹染色單體間發(fā)生過(guò)交換

這個(gè)學(xué)說(shuō)的核心是：交叉是交換的結(jié)果，而不是交換的原因。也就是說(shuō)，遺傳學(xué)上的交換發(fā)生在細(xì)胞學(xué)上的交叉出現(xiàn)之前[1]。

由圖3可見(jiàn)，交換曾發(fā)生在非姊妹染色單體2和3及2和4之間。如果交換發(fā)生在兩個(gè)特定的所研究的基因之間，則出現(xiàn)染色體內(nèi)重組，形成交換的產(chǎn)物。否則，交換發(fā)生在所研究的基因之外，則得不到特定基因的染色體內(nèi)重組的產(chǎn)物。

一般情況下，染色體愈長(zhǎng)，顯微鏡下可以觀察到的交叉數(shù)愈多。一個(gè)交叉就代表一次交換。一般是兩個(gè)基因在染色體上的距離越遠(yuǎn)，其互換的比率越大；距離越近，互換率越小，

同源重組要求兩個(gè)DNA分子的序列同源，同源區(qū)域越長(zhǎng)越有利，同源區(qū)太短，越難發(fā)生重組。大腸桿菌染色體重組，至少要求有20～40 bp是相同的。

因此，交換值(crossing-over value)的大小就可以用來(lái)表示基因間距離的長(zhǎng)短。交換值無(wú)法直接測(cè)定，而只有通過(guò)基因之間的重組頻率來(lái)估計(jì)所發(fā)生交換的頻率。既然連鎖基因的交換率(即重組頻率)可以代表基因在同一染色體上的相對(duì)距離，那么人們就有可能根據(jù)基因的重組頻率來(lái)確定它們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置。

基因定位(gene mapping)即根據(jù)重組值確定不同基因在染色體上的相對(duì)位置和排列順序。遺傳圖(genetic map)或染色體圖(chromosome map)也是依據(jù)基因之間的重組值(或交換值)，確定連鎖基因在染色體上的相對(duì)位置而繪制的一種簡(jiǎn)單線性示意圖。兩個(gè)基因在染色體圖上距離的數(shù)量單位稱為圖距(map distance)。1%重組值去掉其百分率的數(shù)值定義為一個(gè)圖距單位(map unit, mu)。后人為了紀(jì)念現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基人摩爾根，將圖距單位稱為“厘摩”(centimorgan, cM)，1 cM=1%重組值去掉%的數(shù)值。

連鎖和交換這一對(duì)名詞在遺傳學(xué)上被延用下來(lái)。1912年摩爾根提出連鎖互換定律，其基本內(nèi)容是：處在同一染色體上的兩個(gè)或兩個(gè)以上基因遺傳時(shí)，聯(lián)合在一起的頻率大于重新組合的頻率。重組型的產(chǎn)生是由于配子形成過(guò)程中，同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生了局部交換的結(jié)果。

2.2 交叉假設(shè)的證實(shí)

交叉理論雖然得到遺傳學(xué)家的支持，卻遭到細(xì)胞學(xué)家的反對(duì)，因?yàn)檎也怀隼碚撝杏嘘P(guān)斷裂和重接的任何證據(jù)。從顯微鏡照片上來(lái)看確實(shí)很難想象存在斷裂和融合的現(xiàn)象。直到1928年，貝林(Belling)提出交換發(fā)生在減數(shù)分裂較早時(shí)期，此時(shí)同源染色體精密相連，因此在雙線期觀察到的交叉并不表明交換的過(guò)程，而是交換的直接結(jié)果，這一解釋結(jié)束了近十年的爭(zhēng)論。但有一個(gè)問(wèn)題仍使人們感到困惑，那就是交叉點(diǎn)是在變化的，在接近細(xì)胞分裂中期1時(shí)明顯減少了，而交換一旦發(fā)生數(shù)目應(yīng)是固定的，因此科學(xué)家仍然懷疑交叉學(xué)說(shuō)。1931年，英國(guó)的植物細(xì)胞學(xué)家達(dá)林頓(Darlington C. D.)發(fā)現(xiàn)，交叉數(shù)目減少是交叉端化的結(jié)果，此時(shí)才排除了異議[2]。

1978年蒂斯(Tease C.)和瓊斯(Jones C. H.)采用姊妹染色單體差別染色(SCD)來(lái)直接檢驗(yàn)交叉和重組的關(guān)系。SCD法可將姊妹染色單體一條染上顏色呈現(xiàn)深紫色，顯示為暗的；另一染不上色，顯示為明的。他們用SCD法來(lái)處理蝗蟲(chóng)細(xì)胞減數(shù)分裂的染色體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明暗轉(zhuǎn)換發(fā)生在交叉處(圖4)。這就澄清了前面留下的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)表明交叉正是發(fā)生交換的位點(diǎn)。

圖4 在減數(shù)分裂中非姊妹染色單體深色鏈和淺色鏈之間發(fā)生交換：(a)表明交叉；(b)當(dāng)著絲粒附著到紡錘絲上拉向兩極時(shí)，形成中央帶有交叉的十字形結(jié)構(gòu)；(c)十字形結(jié)構(gòu)的照片

摩爾根在1926年的言論中提到線性排列的基因通過(guò)“互換”而重新組合的概念，這種“交換”的真實(shí)存在性直到1931年才被芭芭拉?麥克林托克(McClintock B.)在玉米中以及柯特?斯特恩(Stern C.)在果蠅中證實(shí)。

3 染色體交換模型

在20世紀(jì)30年代中期出現(xiàn)了染色體交換的兩種假設(shè)：復(fù)制選擇模型和斷裂重接模型。按照復(fù)制選擇模型，兩個(gè)染色單體作為復(fù)制的模板進(jìn)行復(fù)制，在復(fù)制過(guò)程中相互交換模板，從而造成交換。按照斷裂重接模型，兩個(gè)染色單體在同一位置上斷裂，然后彼此和另一染色單體重新連接起來(lái)。

3.1 斷裂重接模型

同源重組涉及參與重組的雙方DNA分子的斷裂與重接。人們已從細(xì)胞水平上證明在減數(shù)分裂前期，同源染色體配對(duì)，兩條非姊妹染色單體之間發(fā)生斷裂、重接和交叉。1937年，達(dá)林頓仔細(xì)地觀察研究了減數(shù)分裂的過(guò)程，提出重組的斷裂和重接的模型。他認(rèn)為在減數(shù)分裂中一對(duì)同源染色體相互分離就像將繩子的兩股分開(kāi)一樣，會(huì)產(chǎn)生扭曲，為了消除張力，只有當(dāng)兩姊妹染色單體在對(duì)應(yīng)點(diǎn)發(fā)生斷裂才能使張力達(dá)到平衡，然后非姊妹染色單體的“斷頭”相互重接，產(chǎn)生了重組。根據(jù)這個(gè)模型重組應(yīng)發(fā)生在四線期，因重組是一個(gè)相互的過(guò)程，所以重組的產(chǎn)物也應(yīng)當(dāng)是對(duì)稱的[2]。

染色體斷裂并發(fā)生再連接的最有力的證據(jù)是來(lái)自于哈佛大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)家梅塞爾森(Meselson M.)和韋格勒(Weigle J.)所做的實(shí)驗(yàn)。1961年，他們用兩個(gè)品系的λ噬菌體同時(shí)感染大腸桿菌(E. coli)。一個(gè)品系λ噬菌體在染色體一端具有標(biāo)記基因c和mi，這個(gè)品系用同位素13C和15N進(jìn)行標(biāo)記，因而形成“重”鏈。另一個(gè)品系的相應(yīng)座位帶有c＋和mi＋標(biāo)記基因，并以12C和14N作為標(biāo)記，因而具有“輕”的DNA鏈。兩種噬菌體混合感染大腸桿菌細(xì)胞后，培養(yǎng)在正常的培養(yǎng)基中，直到裂解。后代噬菌體從裂解細(xì)胞中釋放出來(lái)，收集后進(jìn)行子代噬菌體DNA的氯化銫密度梯度離心，結(jié)果獲得了很寬的噬菌體帶。在一系列的條帶中，既有重鏈和輕鏈兩個(gè)親本類型的染色體，也有一系列重鏈與輕鏈發(fā)生斷裂重新接合的中間類型。從遺傳標(biāo)記方面也證明了不僅具有c mi和c＋mi＋親本組合，同時(shí)也有c mi＋和c＋mi新組合(圖5)。由此表明，重組的發(fā)生必定是通過(guò)DNA的物理斷裂與再接合而實(shí)現(xiàn)的[1]。

3.2 模板選擇模型

模板選擇模型是由貝林首先提出的，但1933年他又撤回了這一假設(shè)。1948年，赫爾希(Hershey A. D., 1908—1997)發(fā)現(xiàn)在噬菌體的雜交中產(chǎn)生的重組子有時(shí)是非對(duì)稱的。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象，他接受了斯特蒂文特(Sturtevant A. H.)的建議，提出了在噬菌體中重組可能不是遺傳結(jié)構(gòu)的斷裂和重接，而是復(fù)制時(shí)改變了模板所致，即兩條染色單體作為復(fù)制的模板，新的染色單體各以一個(gè)單體模板進(jìn)行復(fù)制，在復(fù)制過(guò)程中相應(yīng)交換模板，從而造成重組(圖6)[2]。

圖5 λ噬菌體的染色體斷裂與重接的證據(jù)：(a)兩個(gè)品系的λ噬菌體(c mi,＋＋)感染大腸桿菌；(b)氯化銫密度梯度離心顯示輕鏈親本(上層)、中間類型(中)和重鏈親本(下)三種條帶；(c)兩個(gè)標(biāo)記(c mi)間的交換所產(chǎn)生的重組(c,＋)后代，進(jìn)一步證明了DNA的斷裂與重接

圖6 斷裂重接模型和選擇復(fù)制模型的比較

模板選擇模型能夠很好地解釋基因轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，因此在20世紀(jì)50年代興盛起來(lái)。1964年，Holliday模型的提出者霍利德(Holliday R.)[3]在《真菌中基因轉(zhuǎn)換的機(jī)制》一文中對(duì)模板選擇模型受到支持提出了緣由。他寫(xiě)道：“模板選擇假設(shè)的好處是它做出了幾個(gè)十分特別的預(yù)測(cè)：①基因物質(zhì)的復(fù)制是連續(xù)不斷的；②基因配對(duì)先于基因復(fù)制或與基因復(fù)制同時(shí)發(fā)生；③如果把這個(gè)假設(shè)用于解釋交換和轉(zhuǎn)換，并消除通過(guò)斷裂和再接合引起的姊妹鏈交換，那么沿著染色體長(zhǎng)度連續(xù)的交換應(yīng)該包含相同的兩個(gè)染色單體；④在一個(gè)給定的雜合子位置處，從突變體轉(zhuǎn)換到野生型等位基因和從野生型轉(zhuǎn)換到突變體等位基因應(yīng)該以相同的頻率出現(xiàn)；⑤在相同的基因內(nèi)，在不同的突變體之間的交叉中，轉(zhuǎn)換到野生型等位基因的頻率應(yīng)該正比于這些突變體之間的距離，于是允許用附加的重組頻率構(gòu)建線性基因圖譜?！苯又?，霍利德又指出模板選擇模型遇到的困難。他指出：“顯然，預(yù)測(cè)①～③暫時(shí)沒(méi)有得到實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持，在別處已經(jīng)充分討論了模板選擇模型的這些困難。此外，累積的證據(jù)不支持預(yù)測(cè)④。1962年Kaniti等發(fā)現(xiàn)在芽孢顏色突變體和野生型的交叉中，從突變體到野生型等位基因的轉(zhuǎn)換頻率大約是在反方向上轉(zhuǎn)換頻率的1/5……在許多研究中似乎是證明了預(yù)測(cè)⑤?！盵3]

圖7 同源染色單體的重組和有效配對(duì)的各個(gè)階段的圖解說(shuō)明：兩條實(shí)線表示染色單體的DNA雙鏈，而兩條虛線表示其他染色單體的DNA雙鏈；箭頭表示這些鏈的極性；水平短線給出基因中斷處或連接處位置

4 同源重組分子機(jī)制的確立

4.1 Holliday模型

1964年美國(guó)分子生物學(xué)家霍利德提出了揭示同源重組關(guān)鍵步驟的模型，這是一個(gè)解釋同源重組的簡(jiǎn)單但在遺傳學(xué)歷史上極為重要的模型。它很好地解釋了DNA鏈侵入、分支移位和Holliday聯(lián)結(jié)體拆分等同源重組的核心過(guò)程。

Holliday模型的主要內(nèi)容是：①在減數(shù)分裂前期1的雙線期，同源染色體相互靠近，兩條染色單體(雙鏈DNA分子)聯(lián)會(huì)(圖7(a))。②兩個(gè)DNA分子中兩個(gè)方向相同的單鏈(圖7中鏈2和鏈3)，在DNA內(nèi)切酶作用下，在相同的位置上同時(shí)被切開(kāi)。在每個(gè)切開(kāi)的地方雙螺旋稍微解開(kāi)，釋放出單鏈(圖7(b))。③釋放的單鏈通過(guò)和另一分子中沒(méi)有斷裂的鏈互補(bǔ)配對(duì)，而在兩個(gè)DNA分子間進(jìn)行交換，形成一個(gè)由于單鏈交叉使兩個(gè)DNA分子連接在一起的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了關(guān)鍵的重組中間體——Holliday聯(lián)結(jié)體(圖7(c))。④重組過(guò)程的完成需要通過(guò)切斷交叉點(diǎn)附近DNA鏈以拆分Holliday聯(lián)結(jié)體，恢復(fù)兩個(gè)DNA分子。Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分方式有兩種：第一種方式是相對(duì)的鏈2和鏈3，在交叉處第二次被切開(kāi)并再連接，結(jié)果在斷開(kāi)處外產(chǎn)生與原來(lái)完全相同的兩個(gè)非重組DNA，在兩個(gè)切口之間的單倍體區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)換(conversion)，即一個(gè)基因使相對(duì)位置上的基因發(fā)生相應(yīng)的變化所致；第二種分離方式是另外兩條鏈，鏈1和鏈4被切開(kāi)，然后再重新連接，于是會(huì)把半條染色單體的互換變?yōu)檎麠l染色單體的互換，由此產(chǎn)生重組的DNA (圖7(d))。

支持 Holliday模型最為有力的證據(jù)是Potter和Dressler使用特殊的方法在電子顯微鏡下看到了Holliday中間體的結(jié)構(gòu)(圖8)。

不久以后，人們對(duì)Holliday模型進(jìn)行了補(bǔ)充，在Holliday聯(lián)接形成之后，引入了聯(lián)結(jié)體的移動(dòng)步驟：一個(gè)Holliday聯(lián)結(jié)體可以通過(guò)配對(duì)堿基連續(xù)的解鏈和配對(duì)而沿著DNA移動(dòng)。每次移動(dòng)時(shí)，親本DNA鏈上配對(duì)堿基斷開(kāi)，由相同的堿基配對(duì)形成重組中間體，該過(guò)程稱為分支移位(branch migration)。這種移位提高了交換DNA的長(zhǎng)度。如果兩個(gè)DNA分子并不完全相同，如同一基因不同的等位基因間常有的少量序列上的差異，發(fā)生在這些區(qū)域的分支移位形成的DNA雙螺旋將帶有1個(gè)或若干個(gè)序列錯(cuò)配，這種區(qū)域被稱為異源雙螺旋DNA。

4.2 單鏈斷裂模型

1975年，哈佛大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)家梅塞爾森和耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分子生物和生物化學(xué)系教授拉丁(Radding C. M.)在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》上發(fā)表題為《基因重組的一般性模型》的論文。該文的摘要指出[4]：“對(duì)于基因重組提出的一般性模型，它的新的主要特征是假設(shè)由單鏈(或不對(duì)稱的)轉(zhuǎn)移起始的，在同分異構(gòu)化之后，它可能變?yōu)殡p鏈(或?qū)ΨQ的)交換。從不對(duì)稱到對(duì)稱的鏈交換的轉(zhuǎn)變可能確定了在任何特別的有機(jī)體中一定的特征?！敝劣贖olliday聯(lián)結(jié)接的形成以及后來(lái)的拆分，與原來(lái)的Holliday模型相比并沒(méi)有做多少變動(dòng)。由此模型可知，在重組事件的起始階段只有一條DNA分子含有非對(duì)稱異源雙鏈區(qū)，到后來(lái)由于異構(gòu)化和分支遷移才使兩條DNA分子上出現(xiàn)對(duì)稱異源雙鏈區(qū)。這一點(diǎn)已由新發(fā)現(xiàn)的異源雙鏈區(qū)上下游部分基因轉(zhuǎn)換頻率和比例的不同而得到證實(shí)。

關(guān)于單鏈斷裂模型，它的基本內(nèi)容是：①兩個(gè)進(jìn)行重組的DNA分子在同源區(qū)域相應(yīng)的位點(diǎn)上只產(chǎn)生一個(gè)單鏈裂口。產(chǎn)生裂口的鏈被DNA聚合酶催化的新鏈合成取代后，侵入到另一條同源的DNA分子之中，與該分子中的互補(bǔ)序列配對(duì)，并在后者中產(chǎn)生了一個(gè)單鏈裂口。②如圖9(AP)所示，進(jìn)一步的鏈轉(zhuǎn)移來(lái)自于在箭頭處聚合酶作用和在箭尾處外切核酸酶作用，鏈置換和鏈同化作用協(xié)調(diào)操作的結(jié)果。因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)只在兩個(gè)相互作用的分子中的一個(gè)上產(chǎn)生一束異源雙鏈DNA，我們稱之為非對(duì)稱鏈轉(zhuǎn)移。從聚合作用反應(yīng)獲得的化學(xué)能，迅速地推動(dòng)這個(gè)雙鏈體必要的轉(zhuǎn)動(dòng)。③酶的解離允許結(jié)構(gòu)Ap重新排列，或同分異構(gòu)化(i)，給出結(jié)構(gòu)Ar，如圖9所示。在結(jié)構(gòu)Ap中，與交換位置相接的這條臂是在親代的構(gòu)型中，而在結(jié)構(gòu)Ar中，這條臂是在重組構(gòu)型中。④由于兩個(gè)DNA分子旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散的緣故，在結(jié)構(gòu)Ar中的交叉連接可在任何方向上自由遷移。在另一方面，異源雙鏈DNA可能預(yù)先非對(duì)稱地形成，現(xiàn)在鏈轉(zhuǎn)移是對(duì)稱的，而且可能在兩個(gè)分子上形成異源雙鏈DNA(Sr，圖9)。⑤在上一步中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)Sr可能經(jīng)歷一個(gè)比上述過(guò)程更加復(fù)雜的、可逆的同分異構(gòu)化的過(guò)程(i′)，而且也交換兩個(gè)側(cè)臂的親本的和重組的構(gòu)型，形成結(jié)構(gòu)Sp。這個(gè)結(jié)構(gòu)Sp在物理學(xué)上，而不是在遺傳學(xué)上，等同于Holliday模型中的對(duì)稱性的異源雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。通過(guò)切開(kāi)結(jié)構(gòu)Sr也能直接產(chǎn)生結(jié)構(gòu)Sp。如果能夠起始旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散也能獲得這個(gè)產(chǎn)物。⑥Holliday結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)化使在交換位置的類似鏈的兩個(gè)配對(duì)發(fā)生交換，造成它們兩者對(duì)內(nèi)切核酸酶的攻擊產(chǎn)生敏感，該酶通過(guò)切開(kāi)交叉鏈而終止這個(gè)交換。⑦最后，這個(gè)模型像許多其他流行的模型一樣，假定在異源雙鏈區(qū)域中錯(cuò)誤的堿基配對(duì)必須得到酶的修復(fù)。

接著，作者描述了同分異構(gòu)化的細(xì)節(jié)，如圖10(Ⅰ—Ⅴ)所示。從Holliday結(jié)構(gòu)開(kāi)始，可以把同分異構(gòu)化設(shè)想如下：①在交叉連接處4個(gè)堿基配對(duì)不堆積，產(chǎn)生了對(duì)稱性的結(jié)構(gòu)，如圖10(Ⅱ)所示。②分子ab和AB繞著通過(guò)交叉連接處的軸α彼此相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)180°，就產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)Ⅲ。分子模型的檢驗(yàn)揭示出這種轉(zhuǎn)動(dòng)只能在立體空間的意義上才能完成。③分子aB和Ab繞著垂直于第一條軸的第二條軸β彼此相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)180°，給出了結(jié)構(gòu)Ⅳ。這種轉(zhuǎn)動(dòng)也只能在立體空間的意義上才能完成。④在這個(gè)新的交叉連接的任一邊上堿基配對(duì)的再堆積給出了重組結(jié)構(gòu)Ⅴ。

4.3 雙鏈斷裂模型

雙鏈斷裂模型主要是在酵母中獲得的一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上提出來(lái)的。和Holliday模型一樣，這個(gè)過(guò)程也是由同源染色體聯(lián)會(huì)開(kāi)始，但在這個(gè)模型里，始發(fā)事件是兩條DNA分子中的一條發(fā)生了雙鏈斷裂，而另外一條保持完整。因?yàn)殡p鏈DNA斷裂較易發(fā)生，與Holliday模型中所提到的同源成對(duì)斷裂作為起始事件相比，雙鏈DNA斷裂更有說(shuō)服力。然而，兩條DNA分子的非對(duì)稱始發(fā)斷裂，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂模型的后期重組過(guò)程也是非對(duì)稱的。雙鏈斷裂模型認(rèn)為，一個(gè)DNA分子上兩條鏈的斷裂才啟動(dòng)了鏈的交換。兩個(gè)重組DNA分子中產(chǎn)生斷裂的雙鏈被稱為受體雙鏈(recipient duplex)，不產(chǎn)生斷裂的被稱為供體雙鏈(donor duplex)。隨后發(fā)生的DNA修復(fù)合成及切口連接導(dǎo)致形成Holliday聯(lián)結(jié)[5]。

1983年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系史佐斯泰克(Szostak J. W.)等[6]在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表了題為《重組的雙鏈斷裂修復(fù)模型》的論文，提出了雙鏈斷裂啟始重組的模型。具體步驟如圖11所示，由以下5個(gè)階段組成[6]：

(1)內(nèi)切核酸酶切開(kāi)一條染色單體(雙鏈DNA分子)的兩條鏈，導(dǎo)致這個(gè)DNA分子雙鏈發(fā)生斷裂，從而啟動(dòng)重組過(guò)程。這個(gè)雙鏈斷裂的DNA分子既是啟動(dòng)重組的“入侵者”，又是遺傳信息的受體(受體雙鏈)。受到外切核酸酶的作用，雙鏈切口擴(kuò)大而產(chǎn)生具有3′-單鏈末端的空隙。

(2)一個(gè)自由的3′-端入侵供體雙鏈DNA分子同源的區(qū)域，形成異源雙鏈。供體雙鏈的一條鏈被取代，另一條鏈提供了修復(fù)合成反應(yīng)的遺傳信息，產(chǎn)生取代環(huán)(displacement loop，D環(huán))。

(3)由入侵的3′-端引發(fā)的DNA修復(fù)合成導(dǎo)致D環(huán)延伸。D環(huán)最終大到覆蓋受體雙鏈的整個(gè)空隙。新合成的DNA是由被入侵的DNA雙鏈作為模板，于是新合成的DNA序列由被入侵的DNA決定。

(4)當(dāng)供體雙鏈被取代的鏈到達(dá)受體雙鏈空隙的另外一側(cè)，它將和空隙末端的另一個(gè)3′-單鏈末端退火。于是被取代的單鏈提供了序列，填補(bǔ)了受體雙鏈一開(kāi)始被切除的序列。由DNA聚合酶催化的修復(fù)合成將供體雙鏈的D環(huán)轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。DNA連接酶縫合缺口，形成兩個(gè)Holliday聯(lián)結(jié)。

圖11 雙鏈斷裂模型

(5)Holliday聯(lián)結(jié)的拆分有兩種可能的途徑：一種途徑是兩個(gè)切口一個(gè)在內(nèi)側(cè)的鏈，另一個(gè)在外側(cè)的鏈，那么分離得到的是交換產(chǎn)物(crossover product)；另一種途徑是兩個(gè)切口要么都在內(nèi)側(cè)的鏈，要么都在外側(cè)的鏈，得到的是非交換的產(chǎn)物(non-crossover product)。

1994年美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)分子生物研究所斯塔赫(Stahl F. W.)在《遺傳學(xué)》雜志上發(fā)表《Holliday聯(lián)結(jié)30周年》一文。在概述了雙鏈斷裂模型后，作者敘述了雙鏈切口的實(shí)驗(yàn)證明，他寫(xiě)道：“通過(guò)論證減數(shù)分裂重組的啟動(dòng)，已經(jīng)在酵母菌減數(shù)分裂重組的啟動(dòng)中證實(shí)了雙鏈切口的重要性，由發(fā)源于它們的基因轉(zhuǎn)換的梯度(gradients of gene conversion)推斷出重組的存在，重組位于天然的特殊的減數(shù)分裂的雙鏈切口處。這些切口位置的缺失既消除了這些切口又消除了在它們附近的高速率重組?！苯又麛⑹隽穗p鏈斷裂模型與其他兩個(gè)模型的關(guān)系，寫(xiě)道：“應(yīng)該注意這個(gè)雙鏈斷裂模型不僅保留了Holliday結(jié)構(gòu)，而且也保留了Meselson-Radding模型的主要特征：①由于在切口位置處產(chǎn)生的3′端伸出，在切口的每一邊上出現(xiàn)了一個(gè)非對(duì)稱的異源雙鏈DNA的區(qū)域。②一旦形成Holliday聯(lián)結(jié)，它就可能向外滑動(dòng)，形成一個(gè)對(duì)稱的異源雙鏈DNA的區(qū)域?！弊詈笞髡哂终劦紿olliday聯(lián)結(jié)在三個(gè)模型中的作用。作者指出：“Holliday聯(lián)結(jié)的引入，使得該聯(lián)結(jié)已經(jīng)成為重組模型的基礎(chǔ)，因此，生物化學(xué)的調(diào)查研究聚焦于此。通過(guò)在試管中對(duì)分離結(jié)構(gòu)的研究，證實(shí)了在Meselson-Radding模型中假設(shè)的，由Meselson主張的聯(lián)結(jié)滑動(dòng)的能力。后來(lái)的研究揭示了在細(xì)菌中酶促進(jìn)了這種滑動(dòng)。”[7]

(2014年9月12日收稿)

[1] 王亞馥, 戴灼華. 遺傳學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2001: 60-65, 197-199.

[2] 徐晉麟, 徐沁, 陳淳. 現(xiàn)代遺傳學(xué)原理[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 698-701.

[3] HOLIDAY R. A mechanism for gene conversion in fungi [J]. Genetics Research, 1964, 5: 28.

[4] MESELSON M, RADDING C M.A general model for genetic recombination [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1975, 72: 358-361.

[5] 楊榮武, 鄭偉娟, 張敏躍. 分子生物學(xué)[M]. 南京：南京大學(xué)出版社, 2007: 135-137.

[6] SZOSTAK J W, ORR-WEAVER T L, ROTHSTEIN R J, et al. The double-strand-break repair model for recombination [J]. Cell, 1983, 333: 25-35.

[7] STAHL F W. The Holliday junction on its thirtieth anniversary [J]. Genetics,1994, 138: 241-246.

(編輯：段艷芳)

The establishment of homologous recombination mechanisms

XIANG Yihe
Department of Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

The establishment of homologous recombination mechanisms is introduced. The key events include the discover of gene linkage and recombination phenomena, the proposition of chiasmatype hypothesis, the appear of breakage, reunion and copy choice hypothesis, the establishment of three models of homologous recombination: Holliday model, single-strand-break and double-strandbreak repair model for recombination.

linked gene, homologous recombination, chiasmatype hypothesis, Holliday model, single-strand-break model, doublestrand-break model

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.04.007

?通信作者，E-mail：xiangyhts@sina.com