周發(fā)忱，趙 磊，白宇新，遲鑫明，周 欣

1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，遼寧 大連 116044

長鏈非編碼RNA HOTTIP 通過調控細胞凋亡水平促進非小細胞肺癌增殖

周發(fā)忱1，趙 磊1，白宇新2，遲鑫明2，周 欣2

1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，遼寧 大連 116044

背景與目的：探索非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)有效的早期診斷及預后標志物具有重要的科學意義和臨床價值。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤中的作用逐漸引起研究者的關注。本研究擬分析lncRNA HOTTIP在NSCLC中的表達情況及對NSCLC細胞增殖水平的影響和機制。方法：采用實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測方法檢測54例NSCLC組織及其對應癌旁組織的HOTTIP表達情況，分析NSCLC組織HOTTIP表達與臨床病理參數的相關性；MTT方法檢測肺癌細胞增殖水平，流式細胞術檢測凋亡率的改變；蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測目的基因的蛋白表達變化。結果：與癌旁組織比較，HOTTIP在肺癌組織中的表達率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HOTTIP表達與患者淋巴結轉移和TNM分期相關。轉染HOTTIP siRNA至A549肺癌細胞后，結果顯示，與未轉染組和陰性質粒轉染組相比，轉染siRNA-HOTTIP 的A549細胞HOTTIP 表達明顯降低；HOTTIP表達下調后細胞增殖速度減慢，凋亡率增加，凋亡相關蛋白Bax的表達增加，Bcl-2表達減少。結論：HOTTIP是一種新的NSCLC生物標志物，可作為潛在的治療新靶點。

長鏈非編碼RNA；HOTTIP；非小細胞肺癌；增殖；細胞凋亡

肺癌是當今世界對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內，由肺癌引起的死亡率在各種癌癥類型中居首位［1］。在所有的肺癌中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占75%～80%，盡管關于NSCLC的研究目前取得了很多新進展，但是其預后差仍是目前面臨的嚴峻問題。因此，尋找NSCLC有效的早期診斷及預后標志物具有重要的科學意義和臨床價值。將發(fā)現的特征性分子作為抗腫瘤靶點，可為肺癌的臨床預防和治療開辟新途徑。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA，位于細胞核內或細胞質，不具有編碼蛋白質的功能［2］。繼microRNA之后，lncRNA的發(fā)現再次推動了非編碼RNA領域的研究進展。近年的研究結果發(fā)現，lncRNA參與X染色體的基因沉默、基因組印跡、染色質修飾、轉錄激活、核內運輸等多種方式調控基因的表達［3］。有研究發(fā)現，lncRNA參與細胞凋亡、細胞周期等生物學過程，在人類疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［4］。最近，關于lncRNA在腫瘤中的作用已引起人們關注［5］。

HOTTIP是2011年被科學家發(fā)現的一種新lncRNA［6］，HOTTIP在前列腺癌和肝癌等腫瘤中的研究已經取得一定進展，提示其可能在調控腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，但在NSCLC中的作用及機制如何，目前未見相關報道。本研究通過檢測NSCLC組織及癌旁組織中HOTTIP表達，并比較表達差異，分析HOTTIP與NSCLC患者臨床病理參數相關性，進一步通過體外細胞實驗，干預NSCLC細胞中HOTTIP表達水平，分析細胞增殖和凋亡水平的改變。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本

收集大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科2009—2014年手術切除的54例NSCLC患者的癌組織，并選取距離腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織(鏡下未見癌細胞)作為對照。其中：男性34例，女性20例；年齡范圍45～78歲，中位年齡59.8歲；鱗癌31例，腺癌23例；腫瘤直徑≤3 cm 20例，＞3 cm 34例；淋巴結轉移19例，無淋巴結轉移35例；Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期23例；組織學分級Ⅰ級29例，Ⅱ～Ⅲ級25例。所有患者術前均為經過放、化療，標本術后取材后置于液氮中保存。

1.1.2 細胞系

正常支氣管上皮細胞系16HBE、NSCLC腺癌細胞系A549、SPC-A1和鱗癌細胞系SKMES-1購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

1.1.3 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone 公司；TRIzol 試劑、PrimeScript反轉錄試劑盒以及 SYBR PCR Master Mix 均購自寶生物工程(大連)有限公司；siRNA-HOTTIP和陰性對照siRNA以及轉染試劑LipofecamineTM2000購自美國Invitrogen公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；Bax、Bcl-2單克隆抗體均購自美國CST公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；凋亡檢測試劑盒購自晶美生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

上述細胞系傳代培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，其內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 mg/mL鏈霉素，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當細胞融合達到80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 定量實時PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測

應用TRIzol試劑提取細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得 cDNA，進行相關指標的實時熒光定量實驗，以ΔΔCt法進行定量分析，以 GAPDH作為內參，HOTTIP產物的熒光強度比GAPDH擴增產物熒光強度相對量代表HOTTIP相對表達水平。每個實驗重復3次，以H2O為模板作為陰性對照。HOTTIP的上游引物5’-CCTAAAGCCACGCTTCTTTG-3’，下游引物5’-TGCAGGCTGGAGATCCTAGT-3’。

1.2.3 細胞轉染

將NSCLC細胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，待細胞融合至70%進行轉染。分別設立HOTTIP干擾組(si-HOTTIP)、陰性轉染組(si-NC)、空白對照組(blank control)。將LipofecamineTM2000與si-HOTTIP或si-NC混合(終濃度為100 nmol/L)后加入細胞中，溫育6 h后，換完全RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT方法檢測細胞增殖

取對數生長期細胞，按每孔5 000個細胞鋪96孔板，接種培養(yǎng)24、48、72及96 h后終止培養(yǎng)。終止培養(yǎng)前4 h，加入MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)，除去孔中培養(yǎng)基，加入DMSO，振蕩至結晶溶解。酶標儀檢測490 nm波長時各孔吸光度(D)值。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞，消化后收集細胞，用預冷的PBC洗滌2次，以1 mL結合緩沖液重懸細胞，使其密度為1×106個/mL，將100 μL的細胞懸液加入5 mL流式管中，每管加入10 μL Annexin-Ⅴ-FITC染色，隨后加入10 μL PI染色，室溫下避光溫育15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復3次。

1.2.6 蛋白［質］印跡法(Western blot)檢測

將不同處理因素組的細胞培養(yǎng)48 h后，裂解并提取蛋白，用Western blot檢測目的蛋白表達。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動分析成像FluorChem V2.0軟件(Alpha Innotech Corp., USA)對蛋白帶進行灰度值(分別以目的蛋白的整合密度值比內參GAPDH的整合密度值)分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對結果進行分析，數值用x±s 表示。實驗最少重復3次。兩組間比較采用配對t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析方法統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HOTTIP在NSCLC組織和細胞中的表達情況

本研究采用qRT-PCR方法檢測54例肺癌組織及其對應癌旁組織中的HOTTIP表達情況。結果發(fā)現，HOTTIP在癌旁組織中呈低表達，在肺癌組織中表達明顯增加(圖1A)。這提示HOTTIP在NSCLC組織中持續(xù)高表達。

本研究分析了HOTTIP與患者臨床病理參數相關性。結果發(fā)現，HOTTIP在分期較高(T3、T4)患者腫瘤組織中的表達水平明顯高于低分期者(T1、T2)(圖1B)。發(fā)生淋巴結轉移的患者，其腫瘤組織中HOTTIP表達亦明顯高于無淋巴結轉移的患者(圖1C)。

此外，本研究檢測了不同NSCLC細胞中HOTTIP表達水平。結果發(fā)現，與正常支氣管上皮細胞系16HBE相比，HOTTIP 在A549、SPC-A1和SK-MES-1細胞中的表達分別增高4.2倍、3.4倍和2.6倍(圖1D)。

2.2 抑制NSCLC細胞中HOTTIP 表達后增殖減慢

本研究首先驗證siRNA對細胞中HOTTIP 表達的干擾效率。通過qRT-PCR方法檢測A549細胞中轉染siRNA-HOTTIP后HOTTIP 的表達。結果發(fā)現，與未轉染組和陰性質粒轉染組相比，轉染siRNA-HOTTIP的A549細胞，其HOTTIP表達明顯降低，說明該siRNA可沉默A549細胞中HOTTIP的表達(圖2A)。

此外，本研究采用MTT的方法檢測轉染siRNA-HOTTIP后細胞增殖水平的改變。結果發(fā)現，A549細胞中HOTTIP沉默后，細胞增殖活性明顯降低，說明HOTTIP參與NSCLC細胞增殖活性的調控(圖2B)。

2.3 抑制NSCLC細胞中HOTTIP 表達后細胞凋亡增加

采用流式細胞儀檢測A549細胞中轉染siRNA-HOTTIP后細胞凋亡率的改變。結果發(fā)現，與陰性轉染組相比，轉染siRNA-HOTTIP細胞的凋亡率明顯增加(圖3A)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)；同時促凋亡蛋白Bax的表達增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2表達減少。這提示HOTTIP可能通過影響B(tài)ax和Bcl-2蛋白表達調控細胞凋亡(圖4)。

圖 1 HOTTIP在NSCLC中的表達及臨床意義Fig. 1 HOTTIP expression in NSCLC and its clinical significance

圖 2 HOTTIP對A549細胞增殖的影響Fig. 2 The efffect of lncRNA HOTTIP on the cell proliferation in vitro

圖 3 流式細胞儀檢測抑制A549中HOTTIP 表達后細胞凋亡水平Fig. 3 Apoptosis of cells was measured by FACScan after HOTTIP silencing in A549 cell line

圖 4 Western blot方法檢測抑制A549中HOTTIP 表達后凋亡相關蛋白表達Fig. 4 Apoptosis–related proteins were measured by Western blot after HOTTIP silencing in A549 cell line

3 討 論

lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪聲”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，并不具有任何生物學功能。lncRNA異常表達與癌癥發(fā)生關系密切，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。lncRNA異常表達可以存在于正常組織、不典型增生組織以及腫瘤組織中，而特異性表達的lncRNA還可作為腫瘤診斷的標志物［7］。目前基因組分析已發(fā)現了大量的lncRNAs，但是只有少部分lncRNA的功能被研究。其中較為突出的是HOTAIR、MALAT-1。目前已在多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等組織中發(fā)現HOTAIR、MALAT-1的異常表達［8-9］。MALAT-1是第一個在肺癌中被研究的lncRNA，研究發(fā)現其可作為早期肺腺癌患者預后的獨立標志物［10］。此外，有研究報道，HOTAIR高表達狀態(tài)與NSCLC患者淋巴結轉移和臨床分級密切相關，并提示患者的不良預后［11］。本研究中發(fā)現了一種新的lncRNA，即HOTTIP，其可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

HOTTIP基因定位于染色體7p15.2，轉錄本含有4 665個核苷酸，在胚胎發(fā)育過程中可通過與WDR5/MLL復合物作用促進H3K4基因甲基化及臨近的HOXA基因的轉錄激活。Li等［12］發(fā)現，HOTTIP可通過調控HOXA13的表達促進前列腺癌細胞的進展和對吉西他濱的耐藥性。還有研究發(fā)現，肝癌細胞中HOTTIP過表達可促進肝癌的發(fā)生、侵襲力增加，可被miR-125b負性調控［13］。肝癌組織中的HOTTIP過表達與患者侵襲和不良預后相關，可能是預測肝癌預后的生物標志物［14］。Liu等［15］的研究結果發(fā)現，在胃癌細胞中人類同源異型盒(HOX)基因座的反義RNA(HOTAIR)作為ceRNA，通過競爭miR-331-3p，調節(jié)HER-2的表達，影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結果發(fā)現，與正常組織相比，在NSCLC組織和細胞中HOTTIP的表達均顯著上調，提示HOTTIP基因可能在NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因的作用。進一步觀察HOTTIP與NSCLC患者臨床病理參數的相關性，發(fā)現HOTTIP與患者淋巴結轉移數目、臨床分期相關，提示HOTTIP高表達可能參與肺癌的惡性增殖過程。通過生存分析結果發(fā)現，HOTTIP高表達與患者預后不良有關。HOTTIP可能成為判斷NSCLC預后的參考指標。

為進一步探討HOTTIP在NSCLC中的生物學功能，本研究開展了體外細胞實驗。結果發(fā)現，在NSCLC細胞中HOTTIP表達被抑制后，顯著降低了腫瘤細胞的增殖能力，說明HOTTIP可能主要通過促進增殖參與腫瘤的形成。

腫瘤是細胞增殖和凋亡均異常的疾病。有學者指出細胞凋亡的異常比細胞過度增殖在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用更為重要［4］。對此，本研究檢測了細胞凋亡的變化，結果發(fā)現HOTTIP表達下調后，細胞凋亡數增加。由于Bax/Bcl-2比率是啟動細胞凋亡的分子開關，本研究還檢測了凋亡蛋白的表達變化。結果發(fā)現，抑制HOTTIP表達后可增加促凋亡蛋白Bax的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達，進一步證實了HOTTIP的抑制凋亡作用。

綜上，本研究發(fā)現HOTTIP在NSCLC細胞及組織中高表達，其高表達與患者的不良預后相關；下調NSCLC細胞中HOTTIP的表達后可抑制肺癌細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡，提示HOTTIP可能通過影響細胞增殖與凋亡促進NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。這些新的研究發(fā)現將為今后深入研究NSCLC分子機制及治療新靶點提供新思路。

［1］ JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［2］ OKAZAKI Y, FURUNO M, KASUKAWA T, et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs［J］. Nature, 2002, 420(6915): 563-573.

［3］ VILLEGAS V E, ZAPHIROPOULOS P G. Neighboring gene regulation by antisense long non-coding RNAs［J］. Int J Mol Sci, 2015, 16(2): 3251-3266.

［4］ CHEN L L, ZHAO J C. Functional analysis of long noncoding RNAs in development and disease［J］. Adv Exp Med Biol,2014, 825: 129-158.

［5］ YANG G, LU X, YUAN L. LncRNA: a link between RNA and cancer［J］. Biochim Biophys Acta, 2014, 1839(11): 1097-1109.

［6］ WANG K C, YANG Y W, LIU B. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression［J］. Nature, 2011, 472(7341): 120-124.

［7］ DENG G, SUI G. Noncoding RNA in oncogenesis: a new era of identifying key players［J］. Int J Mol Sci, 2013, 14(9): 18319-18349.

［8］ WU Y, ZHANG L, WANG Y, et al. Long noncoding RNA HOTAIR involvement in cancer［J］. Tumour Biol, 2014, 35(10): 9531-9538.

［9］ WANG F, REN S, CHEN R, et al. Development and prospective multicenter evaluation of the long noncoding RNA MALAT-1 as a diagnostic urinary biomarker for prostate cancer［J］. Oncotarget, 2014, 5(22): 11091-11102.

［10］ SCHMIDT L H, SPIEKER T, KOSCHMIEDER S, et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth［J］. J Thorac Oncol, 2011, 6(12): 1984-1992.

［11］ LOEWEN G, JAYAWICKRAMARAJAH J, ZHUO Y. Functions of lncRNA HOTAIR in lung cancer［J］. J Hematol Oncol, 2014, 7(1): 90.

［12］ LI Z, ZHAO X, ZHOU Y, et al. The long non-coding RNA HOTTIP promotes progression and gemcitabine resistance by regulating HOXA13 in pancreatic cancer［J］. J Transl Med, 2015, 13: 84.

［13］ TSANG F H, AU S L, WEI L, et al. Long non-coding RNA HOTTIP is frequently up-regulated in hepatocellular carcinoma and is targeted by tumour suppressive miR-125b［J］. Liver Int, 2015, 35(5): 1597-1606.

［14］ QUAGLIATA L, MATTER M S, PISCUOGLIO S, et al. Long noncoding RNA HOTTIP/HOXA13 expression is associated with disease progression and predicts outcome in hepatocellular carcinoma patients［J］. Hepatology, 2014, 59(3): 911-923.

［15］ LIU X H, SUN M, NIE F Q, et al. LncRNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2 expression by sponging miR-331-3p in gastric cancer［J］. Mol Cancer, 2014, 13: 92.

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主 編：沈鎮(zhèn)宙

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The long non-coding RNA HOTTIP promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells through the regulation of apoptosis

ZHOU Fachen1, ZHAO Lei1, BAI Yuxin2, CHI Xinming2, ZHOU Xin2

(1. Department of Thoracic Surgery, the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning, China; 2. Department of Histology and Embryology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning, China)

Correspondence to: ZHOU Xin E-mail: dl_zhoufch@126.com

Background and purpose: Exploration of the effective early diagnostic and prognostic markers of non-small cell lung cancer (NSCLC) has important scientific significance and clinical value. Recently, the role of long chain non-coding RNA (lncRNA) in the tumor attracts widespread attention. This study intended to investigate the level of lncRNA HOTTIP in NSCLC, the effect of HOTTIP on cell proliferation and its mechanisms. Methods: Expression of lncRNA HOTTIP in tumor and their matched non-tumor tissues were determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in NSCLC patients. Then, we analyzed the potential correlation of lncRNA HOTTIP expression levels in tumor tissues with clinicopathological features of NSCLC and clinical outcome. The effects of HOTTIP on NSCLC cell proliferation and apoptosis were tested using in vitro MTT and flow cytometric assays. Western blot method was uesd to detect the expressions of proteins. Results: LncRNA HOTTIP expression level was significantly decreased in NSCLC tissues in comparison to adjacent non-tumor tissues (P＜0.05). It was also proved that HOTTIP expression was associated with NSCLC histological grade and lymph node metastasis. Moreover, knockdown of HOTTIP expression in A549 cell line decreased proliferation and enhanced apoptosis compared with transfected negative control. Western blot assay showed that the level of Bax protein was significantly increased, whereas Bcl-2 was significantly decreased in HOTTIP-silencing A549 cell. Conclusion: HOTTIP is a novel prognostic biomarker and a potential therapeutic candidate forNSCLC.

lncRNA; HOTTIP; Non-small cell lung cancer; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.002

R734.2

A

1007-3639(2015)09-0652-07

2015-04-09

2015-07-20）

吳階平基金(320675014037)。

周欣 E-mail:dl_zhoufch@126.com