張 瑩，黃旭升，劉 麗，李 懋，張小蘭，陳朝暉，凌 麗

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·論著·

目標區(qū)序列捕獲和第二代測序技術(shù)在Duchenne型肌營養(yǎng)不良基因診斷中的應用

張 瑩，黃旭升，劉 麗，李 懋，張小蘭，陳朝暉，凌 麗

目的 應用目標區(qū)序列捕獲和第2代測序技術(shù)對Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者進行基因檢測，驗證該方法的敏感度和特異度。方法 應用目標區(qū)序列捕獲和第2代高通量測序技術(shù)對19例臨床診斷為Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者進行基因檢測，用Sanger法對8個微小突變患者樣本進行測序驗證。結(jié)果 19例患者均發(fā)現(xiàn)遺傳病因，大片段缺失11例，微小突變8例，經(jīng)Sanger法測序驗證。其中3個微小突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)的新突變。結(jié)論 目標區(qū)序列捕獲和第2代測序技術(shù)可以1次檢測DMD基因幾乎全部的突變類型，極大地提高了檢測效率，該方法敏感度高、特異性強，具有良好的臨床應用前景。

肌營養(yǎng)不良,杜氏；基因檢測; 第二代測序

Duchenne型肌營養(yǎng)不良(duchenne muscular dystrophy, DMD)是以骨骼肌進行性萎縮和腓腸肌假性肥大為主要臨床特征的X連鎖隱性遺傳性疾病，是最常見的肌營養(yǎng)不良類型，發(fā)病率約占活產(chǎn)男嬰的1/3500[1-2],其中約1/3為散發(fā)病例。女性大部分為攜帶者，通常不發(fā)病。DMD及其良性病程表現(xiàn)型Becker型肌營養(yǎng)不良的致病基因抗肌萎縮蛋白基因，位于Xp21.2，由79個外顯子、78個內(nèi)含子和8個啟動子組成，全長2.5 Mb，約占人類全部染色體長度的千分之一，是已知人類基因組中最大的基因[3]，因此具有較高的突變頻率和多種多樣的突變類型。在過去的幾年中，多重PCR(mPCR)[4]、變性高效液相色譜法[5]、多重連接探針擴增技術(shù)[6]、微陣列比較基因組雜交技術(shù)[7]相繼廣泛應用，使得占突變類型約70%大片段缺失或重復可以檢出，但是仍有約30%的微小突變無法診斷[5,8-12]。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的蓬勃發(fā)展，以目標區(qū)序列捕獲和第2代測序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代測序平臺已然逐步建立，可以同時檢測拷貝數(shù)個和單個堿基的突變，具有靈敏度高、特異性強、高通量和低成本等突出優(yōu)勢[13-18]。本文中我們進一步提高檢測的覆蓋區(qū)域，對DMD基因的外顯子,內(nèi)含子以及啟動子上的所有序列(重復性區(qū)域除外)，對目標區(qū)域總共約98%以上的非重復區(qū)域進行基因捕獲和高通量測序分析，進一步探索目標區(qū)序列捕獲和第2代高通量測序技術(shù)在DMD中的臨床診斷價值，并探討其基因型與臨床表型之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2013年12月—2014年12月在解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診，臨床診斷為DMD/BMD的19例男性患者，家族史陰性，父母均為非近親結(jié)婚，所有患者均有運動發(fā)育落后，包括學步延遲、易跌倒和跑、跳、上樓困難，病情逐漸進展出現(xiàn)鴨步、典型Gower征、雙側(cè)腓腸肌假性肥大，不伴肌束顫動和感覺異常、血肌酸激酶水平顯著增高，部分患者曾行肌電圖檢查提示肌源性損害、部分患者曾行肌肉活檢，符合假肥大型肌營養(yǎng)不良改變。本研究獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者的監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 目標區(qū)序列捕獲及高通量測序：先將患者的外周血采用QIAamp血液提取試劑盒(Qiagen，德國)按照產(chǎn)品說明提取基因組DNA，取3 μg DNA經(jīng)Covaris S2超聲儀(Covaris，美國)將其隨機打斷, 打斷樣本片段約為150 bp，純化后的DNA使用T4連接酶和T4堿性磷酸酶及Klenow片段進行末端修復，然后在片段兩端加入A尾，通過接頭連接形成標準的Solexa測序文庫。文庫經(jīng)PCR擴增后，取3 μg DNA與邁基諾基因DMD基因捕獲芯片進行雜交,洗脫的雜交文庫質(zhì)控合格后經(jīng)HiSeq2000 PE100上機測序。用Sanger法對8個點突變患者樣本進行測序驗證。

1.2.2 生物信息學分析：測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制后，使用BWA軟件對數(shù)據(jù)進行比對，使用SOAPsnp和GATK軟件分析樣本突變信息。將得到的樣本突變信息與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)、外顯子組測序項目數(shù)據(jù)庫(ESP6500)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(1000g)及Mygeno本地人群數(shù)據(jù)庫(Inhouse)進行關(guān)聯(lián)分析。第1步：去掉同義突變，去掉在1000 g、ESP6500和Inhouse數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率>1%的突變，HGMD數(shù)據(jù)庫中明確報道過的突變位點在正常人(1000 g、ESP6500和Inhouse數(shù)據(jù)庫)中的頻率可以放寬到5%；第2步：對比HGMD數(shù)據(jù)庫中與樣本遺傳疾病相關(guān)的突變熱點，分析已報道位點的疾病臨床癥狀與樣本臨床癥狀是否一致，如一致則可以考慮該突變?yōu)橹虏⊥蛔?。?步：篩選出氨基酸改變?yōu)閟top gain、frame shift、splicing、stop loss等對蛋白功能影響比較大的突變位點。第4步：結(jié)合基因與疾病的關(guān)聯(lián)信息和樣本的臨床信息，篩選了樣本的致病基因突變。利用對DMD全基因組進行site plot作圖的方法即對每個或每段位點的測序深度進行統(tǒng)計并作圖，找出大片段擴增缺失。

2 結(jié)果

19例患者首診原因絕大多數(shù)為運動發(fā)育落后，個別患者(11例)為發(fā)現(xiàn)心肌酶增高，所有患者均發(fā)現(xiàn)DMD基因突變。8例發(fā)現(xiàn)點突變，包括微小插入2例，微小缺失1例、剪切位點突變1例，無義突變4例。其中3例為首次發(fā)現(xiàn)的新突變，分別為：例3 chrX31645855-31645856 c.7782dupT (p.A2595fs)；例4 chrX32466668-32466669 c.3322delG (p.V1108X) ;例6 chrX31986458-31986459 c.2588dupA (p.K863fs)，見表1、圖1。所有的單堿基突變均經(jīng)Sanger法驗證，與第2代測序的結(jié)果一致。另外11例患者存在大片段缺失，見表2、圖2。

表1 8例Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者DMD基因點突變

注：DMD為Duchenne型肌營養(yǎng)不良；Mutation Taster預測為僅對未見文獻報道的突變進行預測

3 討論

DMD作為一種致死性遺傳性疾病，是兒童期最常見的肌營養(yǎng)不良類型，以進行性加重的近端骨骼肌無力、萎縮，血清肌酶水平增高，腓腸肌假性肥大為主要臨床特征。本研究中患者多以走路延遲、易摔倒為最早的臨床表現(xiàn)，學會走路的平均年齡為16個月?；颊卟∏檫M展迅速，先后出現(xiàn)跟腱攣縮，上肢帶肌、頸前肌無力,12歲左右不能行走。

表2 11例Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者 DMD基因大片段缺失

注：DMD為Duchenne型肌營養(yǎng)不良，BMD為Becker型肌營養(yǎng)不良癥

B

C

圖1 3例Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者首次發(fā)現(xiàn)的新突變位點Sanger法測序圖

A為例3(c.7782dupT)；B為例4 (c.3322delG)；C為6 (c.2588dupA)

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

圖2 11例Duchenne型肌營養(yǎng)不良患者DMD基因大片段缺失

A為例9，45-47號外顯子缺失；B為例10，8-49號外顯子缺失；C為例11(51號外顯子缺失)；D為例12，14-44號外顯子缺失；E為例13，48-50號外顯子缺失；F為例14，49-52號外顯子缺失；G為例15，45-47號外顯子缺失；H為例16，3-30號外顯子缺失；I為例17，38-43號外顯子缺失；J為例18，45-48號外顯子缺失；K為例19，45-47號外顯子缺失

通過DMD基因序列捕獲及第2代測序，19例患者均找到了遺傳病因，11例(58%)為大片段缺失突變，8例(42%)為微小突變。例3的c.7782dupT (p.A2595fsC)突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)，重復的堿基T位于編碼區(qū)第55號外顯子內(nèi)，導致移碼突變，蛋白質(zhì)的第2595位編碼序列由GCC變成TGC，氨基酸由丙氨酸(Ala)變成半胱氨酸(Cys)，并在第2595位之后的第5位密碼子出現(xiàn)終止密碼子TGA，表達只包含前面55個外顯子的截短蛋白。例4的c.3322delG(p.Q1109fsR)突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)，為第27號外顯子1個堿基的缺失導致移碼突變，造成蛋白質(zhì)的第1109位編碼序列由CAG變成AGA，氨基酸由谷氨酰胺(Gin)變成精氨酸(Arg)，并在此后的第2個密碼子就出現(xiàn)終止密碼子TAA，表達截短的抗肌萎縮蛋白，為致病性突變。例6的c.2588dupA(p.T864Nfs)也為微小插入突變，重復的堿基A位于編碼區(qū)第17號外顯子內(nèi)，導致移碼突變，蛋白質(zhì)的第864位編碼序列由ACA變成AAC，氨基酸由蘇氨酸(Thr)變成天冬氨酸(Asn)，并在氨基酸序列第864位之后的第3位密碼子出現(xiàn)終止密碼子TAA，表達只包含前面17個外顯子的截短蛋白。以上3個突變在中國健康人群中沒有發(fā)現(xiàn)，結(jié)合患兒病史、臨床表現(xiàn)及血清CK水平，符合DMD臨床表型，經(jīng)Sanger測序法驗證結(jié)果與NGS技術(shù)結(jié)果相符，因此明確為致病的突變位點。

此外，例2(p.Q869X)，例5(p.G1522X)，例7(p.Q1588X)，例8(p.Q1037X)均為無義突變，單個堿基的突變造成編碼氨基酸的密碼子變成終止密碼子，而表達截短的抗肌萎縮蛋白，患者出現(xiàn)典型的DMD臨床表現(xiàn)。國外文獻報道TGA是DMD患者中發(fā)生頻率較高的終止密碼子[19]，但本研究中的終止密碼子中TAA(4/7)占大多數(shù)，可能與種族差異有關(guān)。

11例大片段缺失突變主要集中在45-54號外顯子附近，與既往文獻中報道的突變“熱區(qū)”相符[20]。1988年Monaco等[21]提出的DMD基因突變“閱讀框規(guī)則”，認為如果突變破壞基因閱讀框，則產(chǎn)生截短且無功能的Dystrophin蛋白,導致發(fā)病早、癥狀重的DMD；若突變未破壞閱讀框，產(chǎn)生的蛋白則可能有部分功能，導致BMD。但仍有病例與此規(guī)則不符，如例16的患者經(jīng)基因檢測證實為3-30號外顯子缺失，突變未破壞閱讀框，但患者18個月起病，目前有明顯頸前肌、下肢肌肉無力，跟腱攣縮，翼狀肩胛、腓腸肌假性肥大，為典型的DMD表型。另外，外顯子缺失的大小范圍與臨床疾病的嚴重程度沒有直接的關(guān)聯(lián)。如例11僅缺失第51號外顯子，引起典型的DMD。然而，也有部分患者盡管存在大片段缺失癥狀仍然較輕微，如例9、15、18、19的45-47號/48號外顯子整碼缺失，但患者平均年齡超過20歲，仍能獨立行走，其中例9行肌肉活檢免疫組化染色檢查未發(fā)現(xiàn)膜蛋白缺陷。有學者發(fā)現(xiàn)，抗肌萎縮蛋白在正常含量的30%以上就能維持機體的正常狀態(tài)，因此，這部分患者由必要行肌肉活檢測定抗肌萎縮蛋白的表達量。

雖然目前在臨床工作中，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，生化檢查中肌酶顯著升高，肌肉活檢病理檢查，特別是免疫組化或免疫熒光技術(shù)直接標記Dystrophin蛋白，可達到確診的目的，但肌肉活檢畢竟是一種有創(chuàng)檢查，在兒童期，特別是幼兒期開展有一定的難度，并且確診后仍無法明確疾病產(chǎn)生的根本原因。而基因檢測能為患者提供準確的遺傳信息，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供可靠的理論依據(jù)，正逐漸成為患者首選的無創(chuàng)檢查手段。自1987年Hoffman等[3]首次定位DMD的致病基因以來，多種基因突變檢測技術(shù)相繼應用，1998年Chamberlain等[4]建立了多重PCR診斷大片段缺失的方法；2002年，多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)開始應用于臨床實踐，并一直沿用至今[6,22-24]，雖然可以對全部79個外顯子進行缺失或重復突變檢測，但越來越多的研究表明MLPA診斷技術(shù)的局限性，如對單外顯子缺失診斷的假陽性[25-27]；微陣列比較基因組雜交技術(shù)可以精確檢測各種拷貝數(shù)變異和定位缺失斷點甚至內(nèi)含子的復雜突變，但是仍不能檢測不涉及拷貝數(shù)改變的微小突變[7]。傳統(tǒng)檢測DMD基因單個堿基突變的Sanger法，雖然準確可靠，但成本高，效率低且不能同時檢測拷貝數(shù)變異，極大限制了其在臨床診斷中的應用。近年來，新一代高通量測序技術(shù)開始應用于遺傳性疾病的基因檢測，2011年Lim等[15]首先利用第2代測序技術(shù)對DMD患者進行測序分析，證明該技術(shù)診斷DMD的可行性，2013年戴毅等[28]建立了基于基因芯片捕獲和高通量測序技術(shù)的DMD微小突變臨床檢測平臺，并報道新突變21種，檢測敏感度97.4%，特異度100%。2014年Wei等[18]針對一大樣本的研究，首次報道了外顯子部分缺失這一新突變類型，并將斷裂點精確到堿基水平。但是我們注意到，以上研究中檢測范圍并沒有包含整個基因序列，僅包含了全部外顯子區(qū)，側(cè)翼序列及部分內(nèi)含子區(qū)域，同時我們發(fā)現(xiàn)仍有患者經(jīng)病理證實確診為DMD但基因檢測未見異常的現(xiàn)象[28]，因此，本文研究中，我們進一步增加目標覆蓋區(qū)域，包含了DMD基因外顯子, 內(nèi)含子以及啟動子上的所有序列，總共檢測目標區(qū)域約2 Mbp中98%以上的非重復區(qū)域。力求為患者提供更全面、準確的基因檢測結(jié)果。19例臨床擬診DMD/BMD的患者均發(fā)現(xiàn)相應的突變，并且經(jīng)過Sanger法驗證，實現(xiàn)了一次檢測DMD基因的幾乎全部突變類型，極大地提高了檢測效率，進一步證實新一代測序技術(shù)具有靈敏度高、特異性強的顯著優(yōu)勢，并且隨著這一技術(shù)的廣泛應用, 檢測的成本將進一步降低，周期也將逐漸縮短。目標區(qū)序列捕獲和第2代測序技術(shù)必將成今后遺傳病基因診斷的主要檢測手段，應用于其他更多遺傳病的臨床基因診斷、產(chǎn)前診斷、高危人群的篩查，不僅能降低現(xiàn)階段遺傳病的發(fā)病率，也為將來遺傳病的基因治療打下基礎(chǔ)，提供準確可靠的理論依據(jù)。

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Target Region Sequence Capture and Second-generation Sequencing Technology in Application of Genetic Diagnosis for Duchenne Muscular Dystrophy

ZHANG Ying1, HUANG Xu-sheng1, LIU Li2, LI Mao1, ZHANG Xiao-lan1, CHEN Zhao-hui1, LING Li1

(1. Department of Neurology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 2. Department of Neurology, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To make genetic diagnosis of Duchenne muscular dystrophy (DMD) patients using target region sequence capture and second-generation sequencing technology, and to validate its sensitivity and specificity. Methods Target region sequence capture and second-generation sequencing technology were used to detect the gene mutations of 19 DMD patients, and 8 micromutation samples were confirmed using Sanger sequencing method. Results All the 19 patients had DMD gene defects including 11 having exon deletions and 8 having point mutations. Three of the mutations were firstly found by Sanger sequencing method. Conclusion Target region sequence capture and second-generation sequencing technology can detect almost all types of mutations in DMD patients with better detecting efficiency, sensitivity and specificity.

Muscular dystrophy, Duchenne; Genetic diagnosis; Second-generation sequencing

100853 北京,解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(張瑩、黃旭升、李懋、張小蘭、陳朝暉、凌麗)；100101 北京，解放軍306醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉麗)

黃旭升,E-mail:lewish301@126.com

R746.2

A

2095-140X(2015)06-0053-07

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.014

2015-02-03 修回時間：2015-03-10)