朱敏立,王小輝,王 萍,李月越,崔 彥

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·論著·

阿托伐他汀對(duì)模擬失重大鼠肺炎鏈球菌感染的保護(hù)作用

朱敏立,王小輝,王 萍,李月越,崔 彥

目的 研究模擬失重狀態(tài)下阿托伐他汀對(duì)上呼吸道定植菌肺炎鏈球菌導(dǎo)致肺部感染的影響，為航天員呼吸系統(tǒng)保護(hù)及感染治療提供理論依據(jù)。方法 將Wistar大鼠40只隨機(jī)分為4組(n=10)，分別為失重感染組(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀組(weightlessness+infection+statin， WIS)、對(duì)照感染組(control+infection， CI)及對(duì)照感染他汀組(control+infection+statin， CIS)。WI和WIS組采用大鼠尾吊法模擬失重狀態(tài)，CI和CIS組在鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，于第3天經(jīng)氣管滴入肺炎鏈球菌懸液0.4 ml，復(fù)制大鼠肺部感染模型。從實(shí)驗(yàn)第1天開始他汀組(WIS組、CIS組)給予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)藥物灌胃，無藥物干預(yù)組(WI組、CI組)給予等量無菌注射用水灌胃。尾吊8 d后處死動(dòng)物取材，測(cè)血常規(guī)、中性粒細(xì)胞黏附分子(CD11b/c)，肺組織切片觀察肺組織病理變化。結(jié)果 肉眼觀察4組大鼠肺組織表面出現(xiàn)不同程度的局部充血及點(diǎn)片狀出血；光鏡下可見肺泡腔內(nèi)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失。上述改變以WI組表現(xiàn)最重，CIS組表現(xiàn)最輕，其中失重大鼠以上葉表現(xiàn)更為突出。各組間白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01)，WI組數(shù)值最高，CIS組最低。各組間血中性粒細(xì)胞CD11b/c比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中WI組大鼠的CD11b/c值最高(167.75±28.39)，CIS組CD11b/c值最低(115.57±18.57)。各組間NEU百分比(NEU%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 模擬失重狀態(tài)下肺炎鏈球菌所致肺部感染炎性反應(yīng)更強(qiáng)，病理損害更重，阿托伐他汀對(duì)肺組織具有保護(hù)作用。

失重模擬；大鼠, Wistar；阿托伐他汀；肺炎鏈球菌

在太空環(huán)境中，重力和輻射的變化對(duì)機(jī)體多系統(tǒng)產(chǎn)生影響，呼吸系統(tǒng)是受失重或微重力影響較為明顯的系統(tǒng)之一。肺除了參與氣體交換，同時(shí)具有一定的免疫防御及免疫調(diào)節(jié)功能，失重時(shí)體液頭向分布，導(dǎo)致肺血容量增加，造成“肺淤血”，不僅導(dǎo)致肺功能受損，同時(shí)其免疫調(diào)節(jié)及抗感染能力下降[1-2]。由于肺直接與外界相通，在上呼吸道有多種細(xì)菌定植，當(dāng)免疫力低下時(shí)有可能進(jìn)入下呼吸道繁殖，從而產(chǎn)生炎性反應(yīng)。本研究觀察失重對(duì)常見上呼吸道定植菌肺炎鏈球菌導(dǎo)致肺部感染的影響，同時(shí)研究該特殊環(huán)境下阿托伐他汀的作用，為航天員呼吸系統(tǒng)的保護(hù)及其疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物分組

1.1.1 主要儀器:FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，KX-21全自動(dòng)血液分析儀(日本希森美康公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(無錫市瑞江分析儀器有限公司)，簡(jiǎn)易細(xì)菌濃度測(cè)定儀(法國(guó)Biomerieux公司)。

1.1.2 主要試劑: 標(biāo)準(zhǔn)肺炎鏈球菌菌株ATCC6303購(gòu)自上海市米寶萊科技有限公司，按說明書配置成所需濃度待用。干預(yù)藥物他汀類為輝瑞制藥公司產(chǎn)品阿托伐他汀。大鼠中性粒細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，Anti-Rat CD11b/c PE、Anti-Rat Granulocyte Marker FITC為美國(guó)eBioscience公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組： 健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，體重(280±20)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組各為10只，分別為失重感染組(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀組(weightlessness+infection+statin， WIS)、對(duì)照感染組(control+infection， CI)及對(duì)照感染他汀組(control+infection+statin， CIS)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。采用陳杰等[3]研究方法建立模擬失重動(dòng)物模型：將失重大鼠(WI組和WIS組)大鼠尾部固定于籠頂，使大鼠后肢恰好離地，保持身體與地面的傾斜度為30°，懸吊8 d，CI組和CIS組大鼠于鼠籠中自由活動(dòng)。4組大鼠于尾懸吊(或鼠籠自由活動(dòng))第3天經(jīng)氣管內(nèi)滴入9×108cfu/ml的肺炎鏈球菌懸液0.4 ml，制作肺炎鏈球菌感染模型。從實(shí)驗(yàn)第1天開始他汀干預(yù)組(WIS組和CIS組)采用阿托伐他汀按照10 mg/kg溶于1 ml生理鹽水后灌胃，每天1次，連續(xù)8 d。無他汀干預(yù)組(WI組和CI組)于同一時(shí)間以等量無菌生理鹽水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測(cè)： 于大鼠尾吊(或地面自由活動(dòng))第8天，以2%戊巴比妥鈉60 mg/kg行腹腔麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血常規(guī)及中性粒細(xì)胞黏附分子(CD11b/c)表達(dá)水平，放血處死后取大鼠右肺上葉組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，行HE染色觀察病理變化。取右側(cè)支氣管肺泡灌洗液送檢微生物培養(yǎng)。參照大鼠中性粒細(xì)胞分離液說明書分離中性粒細(xì)胞，1 ml PBS溶液配成中性粒細(xì)胞懸液后，加入1 μl Anti-Rat Granulocyte Marker FITC和5 μl Anti-Rat CD11b/c PE充分混勻，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b/c表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 經(jīng)氣管注入細(xì)菌后第2天開始，部分大鼠出現(xiàn)精神萎靡，進(jìn)食減少，呼吸困難，4只大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡，其中WI組2只，WIS組及CI組各1只。從肺泡灌洗液中均培養(yǎng)出所注入的肺炎鏈球菌，證明肺炎由所注入的細(xì)菌所致。

2.2 大鼠肺組織病理變化 4組大鼠肺組織大體標(biāo)本肉眼觀察可見肺組織表面不同程度地出現(xiàn)局部充血，部分肺組織表面凹凸不平，局部可見點(diǎn)片狀出血；光鏡下可見肺內(nèi)小靜脈及毛細(xì)血管充盈擴(kuò)張，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失。上述表現(xiàn)以WI組表現(xiàn)最重，CIS組表現(xiàn)最輕，同時(shí)失重大鼠(WI組及WIS組)局部肺組織表面充血和片狀出血以上葉表現(xiàn)更為突出，見圖1。

圖1 光鏡下4組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)(HE×100)

A.對(duì)照感染組：肺泡大小不均，間隔增厚，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；B.對(duì)照組感染他汀組：病理改變較對(duì)照感染組改善；C.失重感染組：肺泡結(jié)構(gòu)基本消失，間隔明顯增厚，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；D.失重感染他汀組：病理改變較失重感染組減輕

2.3 血常規(guī)指標(biāo)比較 對(duì)4組大鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多組間比較結(jié)果顯示，各組間白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，均以WI組數(shù)值最高，CIS組最低。但各組間中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)比較差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。兩兩組間比較顯示，WI組大鼠的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞值均高于WIS組和CI組(P<0.05)；與CI組大鼠比較，CIS組大鼠中性粒細(xì)胞值降低(P<0.05)，CIS組白細(xì)胞值雖然低于CI組大鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CIS組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞值與WIS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組大鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較±s)

注：失重感染組建立失重動(dòng)物模型，給予無菌生理鹽水灌胃；失重感染他汀組建立失重動(dòng)物模型，給予阿托伐他汀灌胃；對(duì)照感染組于鼠籠自由活動(dòng)，給予無菌生理鹽水灌胃；對(duì)照感染他汀組于鼠籠自由活動(dòng)，給予阿托伐他汀灌胃

2.4 中性粒細(xì)胞CD11b/c表達(dá)水平 WI、WIS、CI、CIS組大鼠中性粒細(xì)胞CD11b/c表達(dá)水平分別為(167.75±28.39)、(139.48±25.77)、(140.20±30.14)、(115.57±18.57)。對(duì)4組大鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示4組間大鼠中性粒細(xì)胞CD11b/c表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組間比較，結(jié)果顯示：WI組大鼠中性粒細(xì)胞CD11b/c表達(dá)水平高于WIS組和CI組(P<0.05)，CIS組低于CI組(P<0.05)，CIS組和WIS組大鼠間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

隨著國(guó)內(nèi)外載人航天事業(yè)的飛速發(fā)展，宇航員須在脫離地球重力環(huán)境下生存和完成各種任務(wù)。失重狀態(tài)下，航天員機(jī)體各器官系統(tǒng)將發(fā)生改變，其中肺組織是對(duì)重力改變較為敏感而容易受到損害的器官之一[4-6]。我們此前的研究證實(shí)，模擬失重狀態(tài)下機(jī)體原有內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，免疫系統(tǒng)功能異常，機(jī)體抗感染能力下降，炎性反應(yīng)增強(qiáng)，與國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)基本一致，同時(shí)在肺損傷過程中多數(shù)細(xì)胞因子發(fā)生變化，如TNF-α及IL-6等[6-7]。

隨著太空技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的航天員甚至普通大眾進(jìn)入太空，這種特殊環(huán)境對(duì)人體的影響也逐漸成為熱點(diǎn)。研究顯示太空飛行導(dǎo)致小鼠的脾臟及胸腺重量減低，胸腺中T淋巴細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，從而影響機(jī)體免疫功能[8]。同時(shí)，模擬微重力或失重可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生改變，Qu等[9]采用回旋器模擬微重力環(huán)境，顯示人類神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)一系列氧化應(yīng)激-適應(yīng)-氧化損傷的變化。Cui等[10]實(shí)驗(yàn)從另一角度證實(shí)模擬失重可導(dǎo)致大鼠肝臟的應(yīng)激反應(yīng)。這種在免疫及氧化應(yīng)激系統(tǒng)發(fā)生變化的情況下，機(jī)體容易被致病微生物入侵。

上呼吸道中通常有條件致病菌定植，如溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，一旦體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，這些細(xì)菌可下行導(dǎo)致肺部感染。中性粒細(xì)胞是機(jī)體防御感染的關(guān)鍵細(xì)胞。當(dāng)呼吸系統(tǒng)感染時(shí)，中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺組織來清除致病原，但其同時(shí)也釋放炎性遞質(zhì)，造成肺組織損傷[11]。CD11b/c為一種整合素，是中性粒細(xì)胞重要黏附分子之一，主要儲(chǔ)存在胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)炎性刺激(尤其是細(xì)菌毒素)時(shí)，CD11b表達(dá)上調(diào)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面，介導(dǎo)其與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，到達(dá)炎癥部位，釋放有害物質(zhì)，致組織損害[12]。因此，一般狀況下CD11b表達(dá)水平越高提示肺組織受損越重。本研究結(jié)果證實(shí)，失重組大鼠肺部感染后，CD11b/c表達(dá)高于地面對(duì)照組肺感染大鼠，表明失重大鼠在遭受細(xì)菌感染時(shí)，該黏附分子表達(dá)增加，肺組織受損更重。

他汀類是一種重要的用來抑制膽固醇生物合成的藥物，近年來該類藥物的其他生物效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，并成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，他汀對(duì)參與免疫及炎性反應(yīng)的基因有調(diào)節(jié)效應(yīng)，從而對(duì)感染和腫瘤產(chǎn)生保護(hù)作用[13-14]。有報(bào)道認(rèn)為他汀類藥物可改善肺炎患者的生存率[15]。Hennessy等[16]研究證實(shí)辛伐他汀對(duì)肺上皮細(xì)胞感染銅綠假單胞菌后，參與宿主反應(yīng)的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。他汀類產(chǎn)生這種保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過作用于細(xì)菌和真菌表面抗原進(jìn)而抑制促炎細(xì)胞因子IL-8的活化[17]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重狀態(tài)下肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致肺部炎性反應(yīng)較地面自由活動(dòng)大鼠更為嚴(yán)重，中性粒細(xì)胞及重要黏附分子之一CD11b/c可能發(fā)揮著重要作用。我們采用近年來熱點(diǎn)研究藥物他汀類對(duì)感染大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示失重大鼠肺部感染肺炎鏈球菌時(shí)，阿托伐他汀可減少肺組織損傷，降低炎性反應(yīng)，起到一定保護(hù)作用，但具體機(jī)制以及是否通過CD11b/c發(fā)揮作用，尚需進(jìn)一步研究。

本研究通過阿托伐他汀對(duì)失重大鼠肺炎鏈球菌模型進(jìn)行干預(yù)，觀察中性粒細(xì)胞及其黏附分子的表達(dá)，證實(shí)該藥物對(duì)模擬失重下的肺感染有一定的保護(hù)作用。但人類與大鼠在生物特性上有一定差異，藥物代謝特點(diǎn)也有所不同，因此需進(jìn)一步研究以篩選有效安全的藥物，為航天醫(yī)療保障提供理論依據(jù)。

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Protective Effect of Atorvastatin on Streptococcus Pneumoniae Infections in Rats under Simulated Weightless Condition

ZHU Min-lia, WANG Xiao-huia, WANG Pinga, LI Yue-yuea, CUI Yanb

(a. Department of Critical Care and Respiratory Diseases, b. Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effect of Atorvastatin on pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weightless condition, and to provide the theoretical basis for protection of respiratory system and infection therapy for astronauts. Methods A total of 40 Wistar rats were randomly divided into weightlessness + infection group (WI group,n=10), weightlessness + infection + statin group (WIS group,n=10), control + infection group (CI group,n=10) and control + infection + statin group (CIS group,n=10). The models of simulated weightlessness were established in WI and WIS groups, while the rats in CI and CIS groups were fed in mouse cages with free running space. Bacterial pneumonia models were established in the 4 groups after the rats had been fed for 3 d. WIS and CIS groups were treated with Atorvastatin 10 mg/(kg·d) via intragastric administration on the first experiment day, while WI and CI groups were treated with same volume of sterile water via intragastric injection. The rats were killed at the end of tail-suspension for 8 d. The routine blood test and level of CD11b/c of neutrophilic granulocyte in the blood samples were detected, and the pathological changes of lung tissues in slices were observed. Results In the four groups, local congestion and spot-film hemorrhage in different degrees were found in the surfaces of lung tissues by macroscopic observation; inflammatory cells were infiltrated in the interstitial alveolar space which was mainly a large number of neutrophils under the microscope, and some parts of constructions in the alveolar space disappeared. All of the above pathological changes showed that WI group was the severest, and CIS group was the least, and the changes were more prominent in superior lobe of rats under simulated weightlessness. There were significant differences in white blood cells and neutrophilic granulocyte counts in the four groups (F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01), and the values were the highest in WI group and the lowest in CIS group. There were significant differences in CD11b/c value in the four groups (P<0.01), and the value was the highest in WI group (167.75±28.39) and the lowest in CIS group (115.57±18.57). No significant differences were found in NEU percentage (NEU%) in the four groups (P>0.05). Conclusion Pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weight condition, is more serious in inflammatory reaction and pathological lesions, while Atorvastatin may have protective effects on lung tissues under weight condition.

Weightlessness simulation； Rats, Wistar； Atorvastatin; Streptococcus pneumoniae

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J051)

100101 北京，解放軍306醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科(朱敏立、王小輝、王萍、李月越)，普通外科(崔彥)

王萍，E-mail：pingwang306hpbj@163.com

R856

A

2095-140X(2015)06-0006-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.002

2015-01-12 修回時(shí)間：2015-02-09)