黃玉玲,徐冰心,張 軍,段育忠,楊建武,周金蓮,董滿庫,李成林,崔 彥

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失重環(huán)境感染性疾病與機體損傷的研究

·論著·

RCCS模擬微重力對銅綠假單胞菌毒力編碼基因和蛋白質(zhì)譜的影響

黃玉玲,徐冰心,張 軍,段育忠,楊建武,周金蓮,董滿庫,李成林,崔 彥

目的 探討三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)模擬微重力環(huán)境對銅綠假單胞菌(PA)毒力編碼基因表達及菌體蛋白質(zhì)譜的影響。方法 應用RCCS建立PA ATCC 27853模擬微重力培養(yǎng)體系，實驗組旋轉(zhuǎn)瓶軸心與地面平行模擬微重力環(huán)境，對照組即重力組旋轉(zhuǎn)瓶軸心與地面垂直；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)檢測cDNA樣本中毒力編碼基因外毒素(toxA)、彈性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)、綠膿菌素(phza2)mRNA的相對含量；利用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術及CM10芯片檢測PA菌體蛋白質(zhì)譜。結果 RCCS模擬微重力處理14 d后，Real-time PCR檢測實驗組cDNA樣本中toxA、lasB、rhlA、phza2 毒力編碼基因相對含量均低于對照組(P<0.05)；表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)有82種小分子菌體蛋白質(zhì)[荷比在(2～20)×103Da范圍內(nèi)]，兩組42種菌體蛋白相對含量表達差異有統(tǒng)計學意義，實驗組20種蛋白質(zhì)相對含量表達高于對照組，22種蛋白質(zhì)相對含量表達低于對照組(P<0.05)。結論 RCCS模擬微重力培養(yǎng)條件下PA毒力編碼基因表達和菌體蛋白質(zhì)譜發(fā)生顯著變化。

失重模擬；銅綠假單胞菌；基因表達；蛋白質(zhì)譜

隨著載人航天事業(yè)的迅猛發(fā)展，太空感染問題亟待深入研究。研究表明，微重力環(huán)境不僅導致細菌生物學性狀改變，而且能夠改變機體各部位的菌群構成[1-2]。同時，微重力作為一種特殊的應激原，能夠抑制機體的非特異性免疫系統(tǒng)[3]。隨宇航員和飛行器進入太空的微生物時刻威脅著宇航員的健康及飛行器的安全[4]。銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginos， PA)是一種常見的條件性致病菌，易引起免疫功能低下人群急性感染，并容易產(chǎn)生耐藥性，導致實質(zhì)性組織損傷、系統(tǒng)性蔓延、敗血癥甚至死亡[5]。阿波羅13號宇宙飛船執(zhí)行任務途中，曾有宇航員發(fā)生PA引起的泌尿系統(tǒng)感染[6]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力環(huán)境下經(jīng)口腔灌注PA的大鼠死亡率顯著增加，死亡時間明顯縮短，皮質(zhì)醇水平上升，且器官清除細菌能力顯著降低[7]。本文使用三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)建立PA模擬微重力培養(yǎng)體系，研究模擬微重力環(huán)境對PA菌毒力編碼基因表達和菌體蛋白質(zhì)譜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：PA ATCC 27853標準菌株(中國普通微生物菌種保藏管理中心)。

1.1.2 主要試劑：LB培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司)；Trizol提取試劑盒(上海生工技術服務有限公司)；第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工技術服務有限公司)；Sybr Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystem公司)；管家基因(16S)、toxA、lasB、phzA2、rhlA引物(上海生工技術服務有限公司)；CM10芯片(美國Ciphergen公司)。

1.1.3 主要儀器：RCCS(美國Synthecon公司)；PCR反應擴增儀(美國Applied Biosystem公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)；StepOne型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；超聲波細胞粉碎儀JY 92-2(上海新諾儀器設備有限公司)；蛋白芯片質(zhì)譜儀PBSⅡ-C(美國Ciphergen公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模擬微重力細菌培養(yǎng)：參照文獻[8]，PA增菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整菌液終濃度為103cfu/ml；浸洗細胞培養(yǎng)瓶10 min，棄廢液，加注菌液，排空氣泡，安置培養(yǎng)瓶于RCCS上。實驗組(模擬微重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，對照組(地面重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直，25 r/min、37℃恒溫條件下持續(xù)培養(yǎng)PA，每24 h更換培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)14 d后實驗組與對照組的PA菌體。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)法檢測毒力編碼基因外毒素A(toxA)、彈性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)和綠膿菌素(phza2)mRNA表達：①引物設計：引物序列引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，見表1。②總DNA提取：取1 ml菌液離心，棄上清；加1 ml 1×TE吹打混勻，離心至8000 r/min，棄上清；重復步驟2后，加入溶菌酶和溶葡球菌酶各100 μl，震蕩混勻，37℃水浴1 h。Trizol法提取細菌總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取總RNA，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相。③反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈：采用第1鏈cDNA合成試劑盒，將提取的總RNA經(jīng)二步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。④Real-time PCR法檢測：Real-time PCR反應體系由SybrGreen PCR Master(2X)、forward primer、reversed primer、ddH2O和cDNA template組成。擴增反應在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀上進行，基因擴增條件：2 min 95℃(Hold)，10 s 95℃(Melt)，40 s 60℃(Anneal/Extend)，40個循環(huán)。反應結束后，聯(lián)機生成標準曲線。

表1 PCR引物及擴增產(chǎn)物

注：toxA為外毒素A，lasB為彈性蛋白酶，rhlA為鼠李脂糖，phza2為綠膿菌素

1.2.3 表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測菌體蛋白質(zhì)譜： ①提取蛋白： 收集實驗組與對照組菌體，4℃預冷低鹽PBS洗2次，加入1 ml裂解液，細胞破碎儀震蕩10 s，冰浴20 s，震蕩10 s，如此反復至累計震蕩時間10 min。4℃離心，12 000 r/min，收集上清，即為菌體蛋白溶液。Bradford法定量蛋白，-80℃保存?zhèn)溆?。②標本處理：取出樣品凍融，?0 000 r/min，4℃，離心2 min；每個芯片點需要樣品10 μl，將樣品用2倍體積U9緩沖液稀釋，冰浴震蕩30 min；將30 μl上述樣品與370 μl NaAc迅速混勻。③樣品檢測：CM10 型芯片安裝于加樣器上，在芯片處理器每孔中加入上述處理好的樣品100 μl，置振蕩器300 r/min，室溫震蕩孵育1 h。甩去樣品，結合緩沖液洗2次。每孔加入HEPES(1 mmol/L，pH=4.0)200 μl，取出芯片，待干后，加SPA 0.5 μl 2次。自然干燥后，蛋白芯片閱讀機進行蛋白質(zhì)譜分析。④數(shù)據(jù)采集：將CM10芯片放入蛋白芯片質(zhì)譜儀內(nèi)讀取菌體蛋白信息，用Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0 軟件自動收集數(shù)據(jù)，設定采集條件，最高檢測相對分子質(zhì)量200×103，優(yōu)化Mr范圍2×103～20×103，計算機根據(jù)采集的數(shù)據(jù)繪制出蛋白質(zhì)譜圖。儀器每日用Ciphergen公司的ALL-INONE標準蛋白校正，控制系統(tǒng)質(zhì)量偏差在0.1%內(nèi)。

2 結果

2.1 Real-time PCR檢測結果

2.1.1 RNA樣品純度：實驗組與對照組總RNA凝膠電泳可見清晰的16 S和23 S兩條帶，在近加樣孔處未見DNA條帶。表明所提取RNA不存在基因組DNA污染，未被RNA酶降解。

2.1.2 Real-time PCR溶解和擴增結果： 兩組toxA、lasB、rhlA、phza2基因Ct值均在18～30，與模板濃度具有良好的線性關系。熔解曲線顯示，4個基因均只有一個特異峰，且峰形較銳利，提示擴增反應特異性良好，見圖1(phza2為例)。擴增曲線顯示，曲線拐點清楚，基線平而無上揚現(xiàn)象，各管擴增曲線平行性良好，各反應管擴增效率相近，見圖2(phza2為例)。

2.1.3 Real-time PCR檢測結果： 采用2-△△Ct法對Real-time PCR數(shù)據(jù)進行整理分析，經(jīng)RCCS模擬微重力處理后實驗組lasB、phza2、rhlA、toxA mRNA表達水平分別為0.159±0.005、0.215±0.036、0.203±0.005、0.141±0.019，對照組分別為1.003±0.096、1.005±0.128、1.000±0.020、1.011±0.184。實驗組低于對照組(P<0.05)，見圖3。

2.2 菌體蛋白質(zhì)圖譜分析 PA菌體蛋白質(zhì)圖譜檢測發(fā)現(xiàn)，菌體蛋白質(zhì)荷比(M/Z)在(2～20)×103Da范圍內(nèi)共檢出82個蛋白質(zhì)峰，經(jīng)實驗14 d后，兩組82個菌體蛋白質(zhì)中有42個蛋白質(zhì)相對含量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中20個蛋白質(zhì)實驗組相對含量表達高于對照組(P<0.05)，見表2；22個蛋白質(zhì)實驗組相對含量表達低于對照組(P<0.05)，見表3；蛋白質(zhì)表達峰形圖見圖4。

圖1 綠膿菌素基因?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈反應熔解曲線

圖2 綠膿菌素基因?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈反應擴增曲線

實驗組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直

圖3 兩組毒力編碼基因表達水平比較

實驗組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對照組比較，aP<0.05

表2 兩組20個蛋白質(zhì)相對含量比較

注：實驗組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對照組比較，aP<0.05

表3 兩組22個蛋白質(zhì)相對含量的比較

注：實驗組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對照組比較，aP<0.05

圖4 兩組蛋白質(zhì)表達峰形圖

A.箭頭所指為實驗組質(zhì)荷比為6973 Da的蛋白質(zhì)表達；B.箭頭所指為實驗組質(zhì)荷比為7581 Da的蛋白質(zhì)表達；實驗組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直

3 討論

PA在免疫功能低下及其他特殊情況下易導致急性或慢性感染，往往癥狀嚴重，預防及治療十分困難[9-10]。Crabbé等[11-12]進行模擬微重力培養(yǎng)24 h和飛船搭載培養(yǎng)25 h研究發(fā)現(xiàn)，短期微重力培養(yǎng)后PA藻酸鹽、LasB、rhlA產(chǎn)生增加，其中PA PAO1菌株涉及的多種應激反應蛋白合成、致病因子表達以及各種生理代謝物質(zhì)合成等基因表達上調(diào)，致病性增強。Kim等[13]研究航天搭載連續(xù)培養(yǎng)72 h的PA PA14菌株，寡營養(yǎng)培養(yǎng)條件下比對照組菌株的細菌濃度更高。另有研究表明，模擬微重力處理后PA PAUG2菌株的生長曲線和膜極化值與對照組比較無顯著差異[14]，PA PA103菌株的生長周期及外毒素產(chǎn)量也無顯著差異[15]。

toxA、lasB、rhlA和phza2為PA的毒力編碼基因[10-12]。本實驗經(jīng)RCCS模擬微重力處理14 d后，toxA、lasB、rhlA、phza2 mRNA的表達水平均較對照組降低，顯示PA的致病力減低。這與文獻報道結果不盡一致。本研究中RCCS模擬微重力時間為14 d，分析認為隨微重力暴露時間的延長，PA對微重力環(huán)境可產(chǎn)生適應，多種應激反應蛋白、致病因子、各種生理代謝物質(zhì)的表達合成會發(fā)生一系列變化，進而引起PA毒力因子表達下調(diào)。另外，實驗結果的差異還可能與微重力具體環(huán)境和培養(yǎng)條件不同有關，但具體機制尚待進一步研究。

蛋白芯片質(zhì)譜技術是將芯片概念與質(zhì)譜技術相結合發(fā)展起來的一門新興技術，具有能直接檢測、特異性強、靈敏度高及自動化等優(yōu)點，能夠檢測低豐度、相對分子質(zhì)量低的蛋白質(zhì)，主要適用于相對分子質(zhì)量在(2～20)×103Da范圍內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)或多肽的篩選研究，該技術已用于航天醫(yī)學領域的研究[16-17]。CM10是一種WCX芯片，能與表面帶正電荷的蛋白質(zhì)結合，如賴氨酸、精氨酸或組氨酸，可以用來檢測未知的表面帶有正電荷蛋白質(zhì)或多肽，多用于高等電點蛋白質(zhì)的選擇性分析和生物標記分子的檢測，適用于PA菌體蛋白的蛋白質(zhì)組學研究[18]。Crabbé等[11,19]研究發(fā)現(xiàn)，在模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)24 h，PA毒力蛋白lasB、rhlA及藻酸鹽產(chǎn)量增加，但phza2的產(chǎn)量無明顯變化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在模擬微重力環(huán)境下生物被膜的形成受剪切力的影響，在低剪切力作用下PA PAO1菌株形成黏稠的細胞聚集物，而在高剪切力作用下可形成穩(wěn)固的生物被膜。另有研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力環(huán)境下PA可形成穩(wěn)固的生物被膜，在劇烈振動條件下仍能穩(wěn)固存在[20]。Kim等[21]研究證實，經(jīng)亞特蘭蒂斯號航天飛機太空搭載連續(xù)培養(yǎng)72 h后，PA生物膜數(shù)量增多、厚度增厚、生物膜上活細胞增多，且生物膜結構發(fā)生顯著變化。本研究結果顯示，經(jīng)RCCS模擬微重力培養(yǎng)14 d后，CM10蛋白芯片檢測出82個PA菌體小分子蛋白，其中42個蛋白質(zhì)兩組表達差異具有統(tǒng)計學意義，其中20個蛋白質(zhì)實驗組相對含量表達高于對照組，22個蛋白質(zhì)實驗組相對含量表達低于對照組，這說明微重力環(huán)境能夠影響菌體代謝狀態(tài)，刺激或抑制部分菌體蛋白合成及分解。分析認為，這些表達差異的蛋白質(zhì)在失重應激與應激耐受或適應過程中可能發(fā)揮重要作用，包括影響PA生物被膜生成、多種毒力因子產(chǎn)生及宿主免疫防御系統(tǒng)能力受損等。

綜上所述，隨著空間探索事業(yè)的迅猛發(fā)展，研究太空感染問題、制定合理的防治措施已刻不容緩。據(jù)統(tǒng)計，曾執(zhí)行過航天任務的742名宇航員中，共發(fā)生過29種感染性疾病，包括真菌感染、流感樣疾病、尿路感染、病毒性腸胃炎和皮膚感染等，PA可隨宇航員進入太空環(huán)境，是主要病原菌之一[22]。我們研究發(fā)現(xiàn)，RCCS模擬微重力條件下PA的生物學性狀受到影響，毒力編碼基因和蛋白質(zhì)譜發(fā)生變化，具體機制尚待深入研究。

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Effects of Simulated Microgravity with RCCS on the Expression of Virulence Encoding Genes and Proteinic Profiles of Pseudomonas Aeruginosa Mycoprotein

HUANG Yu-ling1, XU Bing-xin2a, ZHANG Jun2a, DUAN Yu-zhong2b, YANG Jian-wu2b, ZHOU Jin-lian2c, DONG Man-ku2b, LI Cheng-lin2b, CUI Yan2b

(1. Department of General Surgery, the People's Hospital of Daxing District, Beijing 102600, China; a. Department of Special Medical Laboratory Center, b. Department of General Surgery, c. Department of Pathology, 2. 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effects of simulated microgravity with the rotary cell culture system (RCCS) on the expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of Pseudomonas aeruginosa (PA) mycoprotein. Methods The cultured system of PA ATCC 27853 under simulated microgravity were established using RCCS, and the control group was oriented to achieving normal earth gravity, while experiment group simulated microgravity. The relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were detected by real-time PCR (polymerase chain reaction) method. The PA tropina profiles were detected using the surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry and CM10 chip. Results After being cultured for 14 d, the relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were significantly lower than those in control group by real-time PCR detection (P<0.05); 82 types of micromolecule tropina from 2×103to 20×103dalton range were discovered by surface-enhanced laser desorption-ionization time-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) method in control and experiment groups; the differences of 42 types of micromolecule tropina expressions of relative contents in the two groups were statistically significant, and 20 types expressions of relative contents in the experiment group were higher than those in control group, and 22 types' expression of relative contents were lower than those in the control group (P<0.05). Conclusion The expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of PA mycoprotein can be effectively affected after being cultured by RCCS simulated microgravity.

Weightlessness simulation； Pseudomonas aeruginosa； Gene expression； Proteinic profiles

全軍醫(yī)學科研“十二五”重點項目(BWS11J051)

102600 北京，北京市大興區(qū)人民醫(yī)院普通外科(黃玉玲)；100101 北京，解放軍306醫(yī)院特種醫(yī)學實驗研究中心(徐冰心、張軍)，普通外科(段育忠、楊建武、董滿庫、李成林、崔彥)，病理科(周金蓮)

崔彥，E-mail：dryancui@aliyun.com；董滿庫，E-mail：dongmanku1126@sina.com

R378.991；R856

A

2095-140X(2015)06-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.001

2015-02-27 修回時間：2015-03-20)