熊 偉，張曉娟 ，左紹遠，張海洋，馮慕華

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.大理市第一人民醫(yī)院，云南大理 671000）

黑腹果蠅Drosophila melanogaster，也稱黑尾果蠅，是被人類研究得最徹底的生物之一。其名字源于它喜好腐爛的水果以及發(fā)酵的果汁。黑腹果蠅是一種原產(chǎn)于熱帶或亞熱帶的蠅種，易于培養(yǎng)，繁殖快，室溫條件下，10 d就可以繁殖一代，使用經(jīng)濟，且只有4對染色體，易于遺傳操作，有很多突變體可以利用，是遺傳、發(fā)育、生理和行為等的研究方面最常見的研究對象之一。

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（Mitochondrial Transcription Termination Factor，MTERF）是一類存在于多細胞生物中的高度保守的線粒體DNA結(jié)合蛋白，具有相似的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)〔1〕。MTERF蛋白家族不僅在脊椎動物中存在，在昆蟲、蠕蟲等無脊椎動物中也存在，但目前在真菌中仍未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)〔1〕。黑腹果蠅線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（Drosophila melanogasterMitochondrial Transcription Termination Factor，DmTTF）是在無脊椎動物中克隆到的第一個MTERF蛋白超家族成員，分析和研究DmTTF有助于更好地理解黑腹果蠅線粒體基因轉(zhuǎn)錄過程和調(diào)控機制〔2〕。

黑腹果蠅屬于雙翅目，果蠅科。由于繁殖能力強的特點，黑腹果蠅經(jīng)常被當做生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的模式物種。到目前為止，對DmTTF的生物學(xué)研究已經(jīng)有一定的進展，但是對其生物信息學(xué)分析還未見報道。為此，本研究采用生物信息學(xué)方法，對DmTTF的理化性質(zhì)、親水性/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、與其它物種親緣關(guān)系等方面進行預(yù)測和分析，為其后續(xù)研究奠定全面的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 數(shù)據(jù)資料來源于FlyBase網(wǎng)站已經(jīng)注冊的黑腹果蠅線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子DmTTF序列。黑腹果蠅CG18124基因編碼DmTTF蛋白，其中mRNA序列登陸號為NM_135865.4，蛋白質(zhì)序列登陸號為NP_609709.1。1.2 方法 利用ProtParam分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用ProtScale分析蛋白質(zhì)親水性/疏水性；利用TMHMM分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)〔3〕；蛋白序列同源性、多序列比對及序列系統(tǒng)進化樹分別由NCBI protein blast、ClustalX2.0、njplot等軟件實現(xiàn)；利用PSORT II Server和Loctree預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位；利用Smart在線軟件和NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫來分析保守區(qū)域〔4〕；Jpred和Swiss-Model分別預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；String則用來預(yù)測蛋白質(zhì)的相互作用〔5〕。各數(shù)據(jù)庫和軟件的相關(guān)信息如表1。

表1 預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)用的網(wǎng)站及軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 DmTTF蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測和分析 使用ProtParam蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測網(wǎng)站對DmTTF蛋白進行理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果顯示，黑腹果蠅CG18124基因編碼的DmTTF蛋白質(zhì)為410個氨基酸，含量最多的氨基酸為亮氨酸和精氨酸；蛋白質(zhì)分子式C2148H3459N617O607S20，理論分子質(zhì)量為48 281.0，理論等電點為9.62，說明DmTTF是堿性蛋白質(zhì)；DmTTF蛋白的半衰期均達到了30 h；DmTTF蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，表明它不是穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為90.78，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.466，表明它是親水性蛋白質(zhì)。

2.2 DmTTF蛋白親水性/疏水性預(yù)測和分析 利用蛋白質(zhì)親水性/疏水性在線預(yù)測工具ProtScale對DmTTF進行親水性/疏水性分析（圖1）。結(jié)果顯示，DmTTF親水性最強位點出現(xiàn)在67位，分值為-2.800，這個位點的氨基酸是谷氨酸（glutamic acid，E）；DmTTF疏水性最強位點出現(xiàn)在161位，分值為1.644，這個位置的氨基酸是亮氨酸（leucine，L）。ProtScale的預(yù)測結(jié)果顯示DmTTF的親水肽鏈分布在整個氨基酸序列中，且明顯多于疏水肽鏈，預(yù)測結(jié)果也證明它是一種水溶性蛋白質(zhì)。

圖1 DmTTF蛋白親水性/疏水性分析（采用Kyte&Doolittle方法）

2.3 DmTTF蛋白的亞細胞定位分析 通過PSORT II工具預(yù)測DmTTF蛋白的亞細胞定位，結(jié)果表明DmTTF蛋白分布于線粒體、細胞核、細胞質(zhì)和細胞骨架的可能性分別為56.5%、26.1%、13.0%和4.3%。Loctree在線軟件預(yù)測結(jié)果表明該蛋白質(zhì)定位于線粒體，所以DmTTF蛋白可能定位于線粒體中發(fā)揮作用。

2.4 DmTTF蛋白跨膜區(qū)預(yù)測和分析 使用在線蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析工具TMHMM軟件對DmTTF進行跨膜區(qū)分析，見圖2。結(jié)果顯示，DmTTF不含跨膜區(qū)，說明DmTTF不是跨膜蛋白質(zhì)。MTERF蛋白家族是在線粒體DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮作用，屬于線粒體定位，而非膜蛋白，預(yù)測結(jié)果與這一描述相符。

圖2 DmTTF蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

2.5 DmTTF蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括等結(jié)構(gòu)組件，對其預(yù)測和分析有助于認識蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。Jpred軟件由Barton Group創(chuàng)建于1998年，目前最新版本為3.0。Jpred采用Jnnet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，平均準確率大于81%〔5〕。采用Jpred在線預(yù)測軟件對DmTTF的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，DmTTF含有大量α-螺旋區(qū)和1個β-折疊區(qū)。無規(guī)則卷曲和β-折疊區(qū)氨基酸比率分別占到48.91%和0.80%，說明DmTTF大部分氨基酸（50.29%）處于α-螺旋狀態(tài)。

2.6 DmTTF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析 使用Smart在線軟件對DmTTF進行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明DmTTF屬于線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（MTERF）蛋白超家族，含有3個保守的Mterf結(jié)構(gòu)域，分別位于122-152、314-345、346-376位氨基酸，此結(jié)構(gòu)域由大約30個氨基酸組成，其中氨基酸序列同源性高，并且此保守結(jié)構(gòu)域與NCBI提供的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫（Conserved domains database）預(yù)測的保守區(qū)位置基本一致。

2.7 DmTTF蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析對了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性至關(guān)重要，也對理解該蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用機理及位點大有幫助。Swiss-Model是一款采用同源建模的方法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的在線軟件，此外它還能夠預(yù)測蛋白質(zhì)電荷分布、原子間距離和角度等。將DmTTF蛋白的氨基酸序列提交到Swiss-Model，網(wǎng)站給出了預(yù)測結(jié)果，如圖3。結(jié)果顯示，DmTTF蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，且與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。模型評估使用全局法中的QMEANscore4計分值估算，模板（3mvb.1.A）序列建模方法使用X-ray，分辨率為2.79 ?，比對的范圍在73～295aa，覆蓋度達到74.0%，分析結(jié)果表明預(yù)測模型趨近于真實情況。

圖3 DmTTF蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.8 DmTTF相互作用蛋白預(yù)測和分析 使用String 10.0蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測網(wǎng)站對DmTTF進行蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測，結(jié)果如圖4。

圖4 DmTTF蛋白相互作用預(yù)測

與DmTTF相互作用最緊密的10個蛋白質(zhì)及預(yù)測結(jié)果得分（可靠性）見表2。結(jié)果顯示，與DmTTF相互作用最緊密的10個蛋白質(zhì)均為線粒體DNA轉(zhuǎn)錄因子或線粒體基因組的組成部分，這與DmTTF參與線粒體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的事實相符合。

表2 10種最可能與DmTTF相互作用的蛋白質(zhì)

2.9 DmTTF蛋白的同源性預(yù)測和系統(tǒng)進化樹分析使用Protein Blast軟件對DmTTF蛋白進行同源性分析，數(shù)據(jù)顯示，家蠅Musca demestica、弓背蟻Camponotus flondanus、達氏按蚊Anopheles darlingi、大猩猩Gorilla gorilla gorilla、智人Homo sapiens的線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子與DmTTF進行比較時，比對序列覆蓋范圍（Query cover）分別是100%、80%、73%、21%、21%；在此基礎(chǔ)上的序列相似性（Identity）分別是54%、24%、41%、32%、30%。利用ClustalX2.1程序?qū)mTTF于上述物種同源的蛋白序列進行多重比對，進一步使用niprot軟件對ClustalX2.1比對結(jié)果產(chǎn)生的系統(tǒng)進化樹進行可視化分析，結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示，DmTTF蛋白與家蠅同源蛋白之間進化距離最小，其次是達氏按蚊，與人和大猩猩的進化關(guān)系相對較遠。另外，人和大猩猩的線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白聚為一類，它們之間的進化距離最小。

圖5 蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹

3 討論

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白主要在線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止階段發(fā)揮作用，一方面它能與其它線粒體轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物〔6-7〕；另一方面它還能終止線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄過程〔8-9〕。由于黑腹果蠅繁殖能力強、養(yǎng)殖費用低、突變體多等特點，果蠅被認定為是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的理想生物模型〔10〕。

本研究主要從生物信息學(xué)角度解析了黑腹果蠅線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子DmTTF的部分信息。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，DmTTF蛋白全長410個氨基酸，屬于線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白超家族，不含跨膜區(qū)和信號肽序列，蛋白質(zhì)亞定位于細胞線粒體。通過Smart軟件預(yù)測DmTTF蛋白含有3個保守的Mterf基序，每個基序由大約30個氨基酸殘基構(gòu)成。進一步分析DmTTF的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，兩種分析結(jié)果中α-螺旋和β-折疊的數(shù)量及出現(xiàn)位置基本一致，說明建模結(jié)果可靠，分析結(jié)果有助于闡明DmTTF與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在研究DmTTF與其他蛋白的相互作用結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)與DmTTF相互作用的蛋白均為線粒體轉(zhuǎn)錄因子和線粒體呼吸鏈蛋白〔11-12〕，其預(yù)測結(jié)果有文獻和數(shù)據(jù)庫兩方面的證據(jù)，結(jié)果真實可靠。通過多重序列比對及構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，DmTTF蛋白與家蠅同源蛋白質(zhì)的序列相似性最高，且兩者之間的進化距離最近，說明該蛋白質(zhì)的分子進化與物種的進化是一致的。

本研究的分析結(jié)果對于深入研究DmTTF蛋白在線粒體基因轉(zhuǎn)錄過程中的作用及其調(diào)控機制具有一定的指導(dǎo)意義。

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