孫文潔，章 真

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

結直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢測及臨床研究進展

孫文潔，章 真

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

章真，教授，博士生導師，1988年畢業(yè)于上海醫(yī)科大學醫(yī)學系，2007年獲得復旦大學博士學位，2000—2001年曾在美國MD Anderson癌癥中心放療科進修?，F(xiàn)任復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療中心主任，大腸癌綜合治療組副首席專家。Journal of Radiation Oncology雜志編委。NCI直腸癌工作小組成員，美國放射治療協(xié)會會員，中國腫瘤治療指南胃癌治療規(guī)范專家組成員，中國腫瘤治療指南癌性貧血治療規(guī)范專家組成員，中國腫瘤治療指南直腸癌治療規(guī)范專家組成員，中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作專業(yè)委員會委員，中國抗癌協(xié)會大腸癌專業(yè)委員會常務委員，放療學組組長，中華醫(yī)學會放射治療專業(yè)委員會常務委員，中國抗癌協(xié)會放射治療專業(yè)委員會委員，中國老年學學會老年腫瘤專業(yè)委員會胃腸分委會常務委員。擅長胃腸道腫瘤、惡性淋巴瘤、乳腺癌及其他腹部和盆腔腫瘤的放射治療和綜合治療。研究方向主要為消化道腫瘤的綜合治療、放療新技術、圖像引導放療的應用及腫瘤的個體化治療。

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，雖然綜合治療的開展使其療效有較大改善，但仍有較多患者死于術后的復發(fā)和轉移。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）來源于腫瘤組織，與腫瘤轉移及預后密切相關。對CTC檢測方法及其在結直腸癌中的臨床研究進行綜述。

結直腸癌；循環(huán)腫瘤細胞；檢測；治療

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，雖然手術及放化療等治療手段的不斷改進使得其療效有較大改善，但仍有較多患者死于手術后的局部復發(fā)和遠處轉移。癌細胞在腹腔、淋巴結及外周血中的微轉移是導致結直腸癌術后復發(fā)和轉移的主要原因，因此及時發(fā)現(xiàn)微轉移對于指導臨床治療及判斷預后具有重要作用。

外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的概念在1896年由Ghossein等［1］首先提出。CTC來源于腫瘤組織，在各種細胞因子的作用下，腫瘤細胞進入血液循環(huán)即形成CTC，大多數(shù)CTC在人體免疫機制的對抗下短期內(nèi)發(fā)生死亡，只有極少數(shù)具有高度活力和高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展成為轉移灶［2］。近年來，檢測技術的發(fā)展促進了CTC的進一步研究，CTC與腫瘤轉移及預后密切相關，并且有望成為新的預測疾病進展及指導臨床治療的有效指標。本文對CTC的檢測方法及其在結直腸癌中的臨床研究進行綜述。

1 CTC的富集方法

由于CTC在外周血中的數(shù)量極少，通常需要在1億個白細胞和500億個紅細胞中尋找僅有的幾個腫瘤細胞［2］，因此為了提高CTC的檢出率，通常需要在檢測前對CTC進行富集。富集技術主要是通過一些物理或化學原理將這些細胞特異性地收集，目前CTC的富集方法主要包括免疫磁珠分離技術、密度梯度離心技術及基于腫瘤細胞大小的分離法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）。

1.1 免疫磁珠分離技術

免疫磁珠分離技術是富集CTC最常用的方法，這一方法的原理為表面包被抗體的磁珠直接與靶細胞表面的抗原進行抗原抗體反應，這些結合了磁珠的細胞一旦置于強大的磁場下，就會與其他未被結合的細胞分離。與反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）相比，免疫磁珠分離技術最大的優(yōu)勢是分離細胞的可視性和可定量性，具有高分離率和高特異性，且不影響細胞活性，避免了細胞裂解對實驗結果的影響［2］。免疫磁珠分離技術分為陽性篩選和陰性篩選。陽性篩選使用表面偶聯(lián)抗目的細胞抗體的磁珠，細胞與磁珠結合后，直接在磁場中被分離出來。陰性篩選通過去除無關細胞使目的細胞得以純化。在檢測中陽性篩選的效率受到腫瘤細胞表面靶抗原表達強弱的影響，抗原表達弱的腫瘤細胞可能丟失。CellSearch系統(tǒng)是利用免疫磁珠分離技術的典范，已經(jīng)被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）指定用于轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌患者的檢測和治療，但是由于一些CTC不表達上皮類抗原及非上皮性細胞的存在，CellSearch系統(tǒng)仍存在一定的缺陷［3］。在使用陰性篩選檢測CTC時，一般選擇白細胞表面的CD45或巨噬細胞、血小板表達的CD61，通過陰性選擇可以去除無關細胞以篩選出腫瘤靶細胞，但這種方法雖然富集效率較高，但特異性較差。

1.2 密度梯度離心技術

密度梯度離心技術是樣品在一定惰性梯度介質溶液中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離技術。經(jīng)過離心后，從底層到表面依次是紅細胞層、中性粒細胞層、分離液層、單核細胞層（淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞、腫瘤細胞）、血漿層。該方法分離腫瘤細胞對設備、技術要求不高，過程易于掌握，分離的腫瘤細胞形態(tài)保存完整，可再通過免疫染色等技術從形態(tài)或分子特征等方面鑒別腫瘤細胞。但是該方法仍有一定的局限性，如果全血與分離液混合后不立即進行離心，血細胞有可能滲入分離液而不利于分離，而且腫瘤細胞有時可遷移至血漿層，造成分離過程中丟失腫瘤細胞［4］。Oncoquick就是基于密度梯度離心技術，在常規(guī)方法上增加了多孔的屏障，能使分離出的目的細胞純度更高，從而提高了CTC的檢出率［5］。RosetteSep應用微量成像（RosetteSep-applied imaging rare event，RARE）是以陰性選擇為基礎的密度梯度離心技術，在陰性選擇過程中，白細胞CD45陽性細胞與多種紅細胞交聯(lián)結合形成四聚體復合物，通過密度梯度離心技術去除這些復合物后分離出CTC［6-7］。

1.3 ISET

由Vona等［8］提出的ISET主要根據(jù)腫瘤細胞與血細胞的大小不同來分離腫瘤細胞。該方法利用直徑為8 μm的濾膜過濾經(jīng)過固定處理的外周血，腫瘤細胞及較大的血細胞被截留在膜上。此方法敏感度高，1 mL血中只摻入1個腫瘤細胞也可檢出，分離的腫瘤細胞形態(tài)保存完整，表面的抗原或分子標記均未破壞，可再通過光學染色或免疫染色從形態(tài)學特征或分子特征等識別腫瘤細胞。且該方法對設備、技術要求不高，過程易于掌握。經(jīng)過過濾后絕大多數(shù)的血細胞被去除，只有包括腫瘤細胞在內(nèi)的少數(shù)較大的細胞留在膜上。有學者用多種不同孔徑的膜進行對比研究，結果顯示，用8 μm大小孔徑的膜分離外周血腫瘤細胞效果最佳，但這也意味著ISET只能分離直徑大于8 μm的腫瘤細胞，而目前尚無報道證實所有的腫瘤細胞都大于8 μm，使其分離的敏感度受到質疑［9］。近年來還逐漸發(fā)展了微流控芯片技術，該技術是把生物、化學及醫(yī)學分析過程中的樣品制備、反應、分離和檢測等操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上， 自動或半自動完成分析全過程的新型技術，具有檢測率高、成本低的特點［10-11］。Zheng等［10］利用單層聚對二甲苯-C膜微過濾的方法獲得了89.5%±9.5%的前列腺癌細胞的捕獲率。Bhagat等［11］利用收縮膨脹陣列排布的矩形微管道獲得了超過90%的乳腺癌細胞株MCF-7的捕獲率。

2 CTC的檢測方法

2.1 以形態(tài)學為基礎的CTC檢測方法

常用的方法包括免疫細胞化學法（immunocytochemistry，ICH）、激光掃描細胞計量技術（laser scanning cytometry，LSC）和光導纖維陣列掃描技術（fiber-optic array scanning technology，F(xiàn)AST）等。這類方法主要是通過使用不同上皮抗原的單克隆抗體來檢測CTC，最常用的抗體有CK抗體和EpCAM抗體。ICH是利用抗原與抗體特異性結合的原理，使顯色劑標記的抗體與特異的腫瘤標志物結合，通過酶和底物反應顯色或其他顯色方法顯色以判斷腫瘤細胞的存在。但是單純ICH方法敏感度較低，目前較少單獨應用。LSC是高通量細胞分析儀，具有流式細胞儀和圖像細胞儀的功能，通過連續(xù)掃描熒光顯微鏡下圖像自動分析數(shù)據(jù)，可在一定時間（30～60 min）內(nèi)在顯微鏡下自動篩查5×104個細胞，如與細胞富集技術相結合經(jīng)過熒光染色后可達到在107個細胞中發(fā)現(xiàn)1～2個腫瘤細胞的敏感度［12］。LSC能通過目鏡直接觀察細胞及細胞核形態(tài)，可對細胞的微細結構進行定性、定量和定位分析。Pachmann等［13］首次將LSC運用于外周血CTC的檢測，對細胞進行重新定位后直接觀察、定量，檢測各期的乳腺癌和肺癌患者，臨床檢測陽性率達92%，特異度為97%。FAST也是近年來出現(xiàn)的高通量的檢測技術，1 s能掃描3×105個細胞［14］。

CellSearch系統(tǒng)是目前唯一經(jīng)FDA批準上市的檢測CTC的方法。首先用包被EpCAM抗體的免疫磁珠富集CTC，被富集的細胞再用細胞核染料DAPI標記，并用熒光標記的CK抗體和CD45抗體分選上皮細胞和白細胞，最終將CK陽性、CD45陰性的細胞用熒光顯微鏡自動分析系統(tǒng)進行鑒別分選［15］。這種技術將細胞富集、熒光抗體染色和自動熒光顯微鏡分析技術相結合，已被用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的臨床實踐中［16］。

近年出現(xiàn)的芯片技術CTC-Chip是一種比CellSearch系統(tǒng)更為先進的技術，該系統(tǒng)由78 000個EpCAM抗體包被的微柱陣列組成［17］。當血液流過微柱陣列時，上皮來源的細胞幾乎全被捕獲，再通過細胞形態(tài)和免疫特征等檢測鑒別，可用于幾乎所有腫瘤的CTC檢測［18］。

2.2 以核酸為基礎的CTC檢測方法

PCR技術檢測腫瘤患者外周血中CTC主要通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體異位產(chǎn)生的異常DNA。雖然該方法靈敏度高，但是由于其易出現(xiàn)假陽性限制了該技術的發(fā)展，而且外周血中CTC和核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測到的游離DNA可能并非真正的腫瘤細胞，因此應用PCR技術檢測CTC的特異度不高［19］。RTPCR是在PCR基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列反轉錄的DNA片段，從而識別組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后RNA水平的異常。由于這些特異性mRNA通常不在正常外周血細胞中表達，且半衰期較短，在細胞死亡后會迅速降解，因此在外周血中檢測到的這些特異性mRNA可以間接提示CTC的存在［19］。與PCR技術相比，雖然RT-PCR可提高腫瘤細胞mRNA表達的鑒別能力，但仍存在一些因素導致假陽性結果，如取樣時上皮細胞污染、腫瘤標志物在外周血的非正常表達或假基因干擾等原因，而且RT-PCR無法進行形態(tài)學觀察及對腫瘤細胞定量是影響其廣泛應用于CTC檢測的最大障礙。有研究表明，惡性腫瘤患者伴隨的炎性反應可能會增加RT-PCR檢測CTC的假陽性率，從而影響檢測的特異度［20-21］。此外，游離的RNA和雜交DNA也可能導致假陽性結果的出現(xiàn)［22］。

3 CTC檢測在結直腸癌患者中的臨床應用

3.1 CTC可評估患者臨床特點

由于CTC來源于腫瘤組織，因此CTC數(shù)量一定程度上可反映患者體內(nèi)的腫瘤負荷情況。目前已有多項研究指出CTC可反映結直腸癌患者的腫瘤浸潤和淋巴結轉移等臨床特點。Sastre等［23］納入了97例結直腸癌患者，指出CTC數(shù)量與臨床分期相關，進展期的患者具有較高的CTC數(shù)量。該研究采用CellSearch系統(tǒng)對CTC進行檢測，在可評估的94例患者中有34例（36%）可檢測到CTC≥2個，中位數(shù)量為3.4個。CTC陽性率（CTC≥2個）與原發(fā)腫瘤部位、升高的CEA或LDH水平及腫瘤分化程度未呈現(xiàn)明顯的相關性。僅有疾病分期與CTC陽性率相關（Ⅱ期：20.7%，Ⅲ期：24.1%，Ⅳ期：60.7%，P=0.005）。同樣，當閾值定義為大于等于3個CTC為陽性時，也顯示分期是唯一與CTC相關的因素（Ⅱ期：12%，Ⅲ期：16%，Ⅳ期：64%，P=0.000 1）。Wong等［24］檢測了132例結直腸癌患者，其CTC檢出率達到62%，而在120例結直腸良性疾病患者和40例健康人中未檢測到CTC，同時發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量與淋巴結轉移與否密切相關。Katsuno等［25］進行的一項Meta分析評估了CTC與結直腸癌患者淋巴結陽性率和肝轉移率的相關性，共納入了646例結直腸癌患者，發(fā)現(xiàn)淋巴結陽性的患者相比陰性的患者具有更高的CTC陽性率（50% vs 21%），同樣CTC陽性的患者具有更高的肝轉移率（21% vs 8%）。Hiraiwa等［26］分析了130例胃腸道腫瘤的患者，發(fā)現(xiàn)轉移性患者的CTC數(shù)量明顯高于非轉移性患者，CTC數(shù)量不僅與患者的臨床分期密切相關，而且與患者是否有腹腔轉移具有明顯相關性。Iinuma等［27］也得出類似的結果，通過對167例結直腸癌患者的分析發(fā)現(xiàn)，CTC可很好地反映患者的臨床病理特點，與患者的腫瘤侵犯深度、血管侵犯、淋巴結轉移及肝轉移等均具有明顯的相關性。以上研究均顯示，CTC可很好地反映結直腸癌患者的臨床病理特點，在臨床應用中，可以通過CTC數(shù)量的信息了解腫瘤疾病的狀態(tài)和嚴重程度，同時可對患者的臨床分期進行補充和修正。

3.2 CTC在預測疾病復發(fā)及判斷預后方面的價值

CTC除了可以及時了解腫瘤的狀態(tài)，還可以對疾病的復發(fā)進行很好的預測。Uen等［28］對438例Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者，分別在手術前和手術后進行CTC檢測，發(fā)現(xiàn)術前和術后CTC情況與術后的復發(fā)相關，術前和術后CTC均陰性組無復發(fā)生存明顯高于術前和術后均陽性組（P＜0.001）。Allen-Mersh等［29］同樣對196例行根治性結直腸癌切除術的患者，在術后24 h進行CTC檢測，發(fā)現(xiàn)術后CTC陽性患者之后出現(xiàn)復發(fā)的危險比高于術后病理淋巴結陽性的患者，而兩者均陽性的患者發(fā)生復發(fā)的概率明顯增加，說明術后進行CTC檢測可預測復發(fā)。Yalcin等［30］檢測了93例結直腸癌患者的CTC，治療后有8例患者CTC數(shù)量下降，14例患者CTC數(shù)量上升，而5例患者未發(fā)生明顯變化。在CTC數(shù)量下降的8例患者中僅有2例患者在治療后出現(xiàn)疾病進展，而在14例CTC數(shù)量上升的患者中則有13例患者出現(xiàn)疾病進展（P=0.001）。同樣地，在5例治療后CTC數(shù)量未發(fā)生變化的患者中，有4例患者出現(xiàn)疾病進展。因此，該研究認為可以通過治療前后CTC的檢測對疾病復發(fā)進行很好的預測。

目前已有多項研究證實了CTC可以對結直腸癌患者的長期生存進行很好的預判。Cohen等［31］通過對430例轉移性結直腸癌CTC的檢測發(fā)現(xiàn)，無論治療前還是治療后CTC的濃度對預后均有預測作用，治療前后CTC均低濃度組的預后明顯優(yōu)于治療前后CTC均高濃度組（P=0.000 1）。影像學和CTC的聯(lián)合檢測能更好地對患者的生存進行評估預測，影像學評估為非疾病進展同時CTC低濃度組的中位生存時間為18.8個月，而影像學評估為疾病進展同時CTC高濃度組的中位生存時間僅為3.1個月（P＜0.000 1）。Van Dalum等［32］前瞻性納入了183例初治的非轉移性結直腸癌患者，中位隨訪5.1年，結果發(fā)現(xiàn)手術前可檢測到CTC的患者具有明顯較低的無復發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）和結腸癌相關生存率（colon cancer-related survival，CCRS），相比于對照組術前CTC陽性患者5年RFS從75%降低至61%，而CCRS從83%降低至69%。多因素分析也顯示，CTC和淋巴結轉移均是RFS的有效預測因素。Huang等［33］進行的一項Meta分析共納入13項研究，指出CTC低濃度的結直腸癌患者的疾病控制率明顯高于CTC高濃度組（P=0.048），CTC高濃度的患者無進展生存率（progression-free survival，PFS）和總生存率（P＜0.001）（overall survival，OS）較差，CTC由低濃度轉化為高濃度的患者以及CTC持續(xù)高濃度的患者PFS（P=0.023）和OS（P＜0.001）較差。

3.3 CTC在預測和評估療效方面的價值

在預測和評估療效方面，CTC檢測同樣具有良好的應用價值，可以根據(jù)CTC檢測結果給予患者個體化治療。Cohen等［31］針對430例轉移性結直腸癌患者，在治療后3～5周檢測CTC，發(fā)現(xiàn)在治療后疾病進展的患者中CTC≥3個/7.5 mL組占73%，而治療后疾病穩(wěn)定或好轉的患者中僅7%的患者CTC≥3個/7.5 mL，CTC評價療效的準確性達到78%。Barbazán等［34］也得出類似的結論，發(fā)現(xiàn)在治療后通過常規(guī)影像學檢查判定為治療有效的患者中仍有部分CTC陽性，而這部分患者具有較差的長期生存，因此該研究指出通過CTC的檢測可以鑒別出常規(guī)影像學檢查無法發(fā)現(xiàn)的對治療抵抗的患者，并且可以及時地給予針對性的治療。隨著對CTC研究的深入，學者們開始針對CTC進行相應的基因檢測，以發(fā)現(xiàn)更多CTC蘊含的生物學信息。多項研究發(fā)現(xiàn)，通過對CTC相應基因的檢測，可以對結直腸癌患者的療效進行很好的預測，包括化療及靶向治療等［35-38］。Hendlisz等［35］評估并對比了化療對于CTC和原發(fā)腫瘤表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達的影響，納入了未經(jīng)過化療的轉移性結直腸癌患者，分別在治療前、第2療程治療前和第4療程治療后進行檢測，14例（64%）患者在治療前CTC呈現(xiàn)EGFR表達陽性，而原發(fā)腫瘤和CTC的EGFR表達無關，14例基線CTC-EGFR陽性的患者，經(jīng)過4個療程化療后，13例仍表達陽性，其中位進展時間為6.6個月，而8例基線CTC-EGFR表達陰性的患者，在4個療程化療后，7例患者EGFR呈現(xiàn)陽性，中位進展時間為8.5個月。該研究表明化療可誘導CTC中EGFR表達狀態(tài)的改變，EGFR陰性的腫瘤在化療后應該重新評估EGFR狀態(tài)，利用CTC-EGFR表達水平可以預測轉移性結直腸癌化療的療效。在實際臨床工作中，在使用西妥昔單抗治療結直腸癌前必須檢測腫瘤組織的K-ras基因，K-ras基因野生型對西妥昔單抗的治療有效，而突變型則療效不佳。Yen等［36］收治76例轉移性結直腸癌患者并給予化療聯(lián)合西妥昔單抗治療，同時檢測其外周血CTC的K-ras基因，發(fā)現(xiàn)CTC與腫瘤組織的K-ras基因突變率具有很好的一致性，通過對CTC的K-ras基因檢測可以很好地預測西妥昔單抗的療效，因此有望取代傳統(tǒng)的對腫瘤組織的基因檢測。Musella等［37］也得出類似的結論，指出通過CTC的檢測可以較早期地預測出抗EGFR治療的療效，Abdallah等［38］檢測并分析了CTC中的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS），用以評估5-FU在轉移性結直腸癌患者中的療效，共分析了34例患者的外周血CTC，發(fā)現(xiàn)9例TYMS表達陽性，其中6例在5-FU治療后出現(xiàn)腫瘤進展，CTC的TYMS表達與腫瘤進展具有明顯的相關性，該研究結果表明通過CTC的TYMS檢測可以預測出對5-FU抵抗的患者，從而可以給予患者個體化的治療方案。

4 總結和展望

結直腸癌在切除術后復發(fā)和轉移率仍然很高，嚴重影響患者的預后，尋找更為有效的方法檢測CTC，不僅有利于術后復發(fā)和轉移的預測，并且為判斷療效、實現(xiàn)個體化治療提供依據(jù)。目前檢測CTC的方法眾多，每種方法均有其優(yōu)點和缺點，而腫瘤細胞存在較大的異質性，不能靠單一的標志物或方法對CTC進行完整分析，因此今后應考慮進行聯(lián)合多種標志物及聯(lián)合多種方法進行檢測。另外，外周血樣本的采集時間一直未得到較大的關注，這牽涉到CTC在循環(huán)中釋放的機制，是隨機釋放還是類似于激素分泌的周期性規(guī)律釋放，目前還尚無定論。而對于某些學者提出的CTC細胞亞群鑒定和針對不同亞群細胞進行個體化治療也是今后研究的新思路。

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Research progress on circulating tumor cells and their detection in colorectal cancer

SUN Wenjie，ZHANG Zhen （Department of Radiation Oncology， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ZHANG Zhen E-mail: zhenzhang6@gmail.com

Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors. Though the development of multidisciplinary therapy has largely improved the therapy effects， many patients still died of local recurrence and metastases after surgery. Circulating tumor cell （CTC） originates from primary tumor tissues and has a close relationship with cancer metastases and prognosis. This review summarizes the CTC detection methods and relevant clinical research on CTC in recent years.

Colorectal cancer； Circulating tumor cell； Detection； Therapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.11.003

R735.3

A

1007-3639（2015）11-0854-07

2015-04-25）

章真 E-mail：zhenzhang6@gmail.com