王建明

（甘肅省莊浪縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 莊浪744699）

為探討豬瘟（CSF）、豬口蹄疫（FMD）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 三種疫苗同時分點免疫對種公豬精液品質(zhì)的影響，以期減少精液生產(chǎn)中因免疫產(chǎn)生不良影響的頻次和持續(xù)時間優(yōu)化公豬免疫程序，保證精液質(zhì)量。

1 材料

1.1 試驗豬只選擇 莊浪縣金鎖生豬養(yǎng)殖有限公司、恒達(dá)生豬養(yǎng)殖有限公司、良邑鄉(xiāng)良怡種公豬站選取杜洛克、長白、大約克3個品種且實驗前精液品質(zhì)符合（GB/T25172-2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》）要求的各項指標(biāo)。

1.2 疫苗選擇 豬 0 型口蹄疫合成肽疫苗（2570+7309），申聯(lián)生物醫(yī)藥(上海)有限公司，批號：20140311001;豬瘟活疫苗（細(xì)胞源），中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，批號：201404062;豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（NVDC-JXA1株)洛昭普萊柯生物工程股份有限公司，批號：20140602。

1.3 儀器設(shè)備 精子密度儀、顯微鏡（帶恒溫載物臺）、電子天平、恒溫水浴鍋、美蘭染色液、計數(shù)器、、血球計數(shù)板、血蓋片、微量移液器、擦鏡紙、吸水紙、玻璃棒、捕豬器、注射器、真空采血管、量杯、量筒、美蘭染液、95%酒精、3.0%氯化鈉溶液、去離子水、75%酒精等。

2 方法

2.1 試驗豬分組及免疫方法 按品種選試驗豬30頭，分為3組：第1組（杜洛克組），10頭，編為D1-D10；第2組（長白組） ,10頭，編為C1-C10；第3組（大約克組） ,10頭編為Y1-Y10。

以上各組均口蹄疫合成肽疫苗頸部左側(cè)肌肉注射,豬瘟活疫苗頸部右側(cè)皮下注射,豬藍(lán)耳病疫苗于臀部肌肉注射,各種疫苗均按照使用說明書規(guī)定的劑量注射，規(guī)范操作。

各組免疫接種后臨床觀察24小時,免疫后每過6小時記錄觀察結(jié)果1次,重點觀察是否出現(xiàn)食欲減退、發(fā)熱、精神頹廢等輕微癥狀和死亡、流產(chǎn)、過敏性休克等強(qiáng)烈反應(yīng)，同時備好地塞米松、腎上腺素等急救藥物，以防止試驗豬死亡。

2.2 免疫抗體監(jiān)測 免疫后第28天采集血清送莊浪縣疫控中心實驗室進(jìn)行抗體檢測，豬瘟免疫抗體檢測采用正向間接血凝試驗，豬O型口蹄疫合成肽疫苗和豬藍(lán)耳疫苗免疫抗體檢測采用間接ELISA法。

2.3 精液品質(zhì)監(jiān)測 在同時免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前，以上各組每3天采集一次精液并進(jìn)行精液品質(zhì)監(jiān)測，共連續(xù)監(jiān)測20次。各組免疫后每3天采集一次精液并進(jìn)行精液品質(zhì)監(jiān)測，同樣連續(xù)監(jiān)測20次，主要監(jiān)測采精量、精子活力、精子密度、精子畸形率4個指標(biāo)。

2.3.1 采精量監(jiān)測 為減少實際操作中因部分玻璃量具導(dǎo)致的誤差，每次精液采集完畢，及時過濾，再用電子天平稱取重量，按1g≈1m l換算體積。

2.3.2 精子活力監(jiān)測 取剛采鮮精，分別用微量移液器取25μl置于載玻片上并加蓋玻片，置于37℃恒溫載物臺上，用顯微鏡400倍觀察精子活力，每樣片觀察3個視野，并觀察不同液層內(nèi)的精子運動狀態(tài)，進(jìn)行計算。三個視野活力檢測的平均數(shù)按照M=(n1+n2+n3)/3式中：M--活力，%；n1--第一視野活力，%；N2--第二視野活力，%；N3--第三視野活力，%。

2.3.3 精子畸形率檢測 取精液一滴滴于載玻片一段，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片一段呈45°夾角，將樣品均勻的涂布于載玻片上，自然風(fēng)干，每個樣品制作3個抹片；待風(fēng)干后，將抹片侵入無水酒精中固定2～3min，取出風(fēng)干；在風(fēng)干的抹片上滴加美蘭染液2 3m l，染色3min；用蒸餾水沖洗干凈，風(fēng)干；置于顯微鏡400～600倍下觀察200～500個精子，計算精子畸形率。計算方法：A=A1/A2×100%式中：A--畸形率，%；A1--畸形精子數(shù)，個；S--精子總數(shù)，個。

2.3.4 精子密度監(jiān)測 使用法國大歐公司CRYO-VET精子密度儀進(jìn)行檢測，具體操作方法：按ON/OFF鍵打開機(jī)器；把加有精液稀釋液的參考樣品加入檢測杯內(nèi)，按下松開“R”鍵，密度儀顯示0.00，此時精子密度儀歸零，取出參考樣品；再用另一只干凈量杯加入5ml新鮮精液進(jìn)行測量；按下松開“T”鍵,顯示屏顯示所測量精液的吸光度，然后查隨機(jī)附帶的《豬精液吸光度-密度轉(zhuǎn)換表》即可檢出該精液的精子密度。

2.3.5 結(jié)果統(tǒng)計與分析方法 精液品質(zhì)檢測的每項指標(biāo)在免疫前和免疫后各有20個數(shù)據(jù),然后將各項監(jiān)測數(shù)據(jù)按品種不同分免疫前和免疫后，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗，在分析比較時用平均值(X)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表述,用單因素方差分析法檢驗免疫前后各監(jiān)測指標(biāo)間的差異顯著性。

3 結(jié)果與分析

3.1 免疫應(yīng)激反應(yīng)觀察結(jié)果 按上述方案免疫后，均未出現(xiàn)強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)。只有杜洛克組有1頭豬在注射疫苗6小時后出現(xiàn)輕度減食（副反應(yīng)率0.67%） 經(jīng)一段時間后恢復(fù)正常。因此說明三種疫苗同時免疫副反應(yīng)發(fā)生較低。

3.2 同時免疫CSF、FMD、PRRS后抗體檢測結(jié)果 免疫后第28天檢測CSF、FMD、PRRS三種疫苗免疫抗體，均達(dá)到農(nóng)業(yè)部要求的合格率70%以上。這可能與所選公豬免疫前基礎(chǔ)抗體的存在有關(guān)。

表1： 三種疫苗同時免疫后第28 天抗體合格率

3.3 采精量監(jiān)測結(jié)果 3個品種公豬注射疫苗前后精液量比較見表2。試驗結(jié)果表明，大約克種豬三種疫苗同時多點免疫后采精量顯著降低（P＜0.05），而長白和杜洛克豬在注射前后精液量無顯著差異。

表2： 3 個品種公豬注射疫苗前后精液量比較

3.4 活力監(jiān)測結(jié)果 活力監(jiān)測結(jié)比較發(fā)現(xiàn)，3個品種公豬在疫苗注射前后精子活力差異均不顯著（P＞0.05）。

3.5 畸形率監(jiān)測結(jié)果 3個品種公豬注射疫苗前后精子畸形率比較發(fā)現(xiàn)，大約克 長白 杜洛克三個品種公豬在同時免疫CSF、FMD、PRRS疫苗后精子畸形率顯著增加（P＜0.05），其中:大約克的畸形率增加了36.0%,直到免疫后第8次監(jiān)測（免疫后27天） 逐漸恢復(fù)至免免疫前水平;長白的畸形率增加了38.4%，直到免疫后第10次監(jiān)測（免疫后33天） 逐漸恢復(fù)至免免疫前水平；杜洛克畸形率增加了33.9%,直到免疫后第9次監(jiān)測（免疫后30天） 逐漸恢復(fù)至免免疫前水平。

表3： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子活力比較

表4： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子畸形率比較

3.6 密度監(jiān)測結(jié)果 3個品種公豬注射疫苗前后精子密度比較發(fā)現(xiàn)，3個品種公豬在疫苗注射前后精子密度差異均不顯著（P＞0.05）。

表5： 3 個品種公豬注射疫苗前后精子密度比較

4 討論

在豬的常溫精液生產(chǎn)中，采精量、精子活力、密度、畸形率是評價原精液是否合格的重要指標(biāo)，根據(jù)本研究3種疫苗同時免疫后公豬精液品質(zhì)持續(xù)監(jiān)測結(jié)果可以看出：長白與杜洛克采精量在免疫前后表現(xiàn)平穩(wěn)，前后差異不顯著（P＞0.05），這與張淑二[[[]張淑二，林雪，劉棟，等.注射口蹄疫疫苗對不同肉用品種種公牛精液品質(zhì)的影響[J]中國草食動物.2011,31（4）：23-25.]]等人在O型口蹄疫疫苗免疫牛上的試驗結(jié)果一致，大約克豬在免疫前后采精量變化顯著（P＜0.05），這與瞳敬賓的研究，大約克豬在注射疫苗前后的精液量差異顯著（P<0.05），其他各品種注射前后差異精液量差異不顯著的結(jié)論完全一致[[[]佟敬賓.注射疫苗對種公豬精液品質(zhì)的影響[J]豬業(yè)科學(xué).2008,9:94-95.]]。這說明3種疫苗同時免疫對公豬采精量有一定影響。

精子活力和密度在3種疫苗免疫前后各品種變化均不顯著（P＞0.05） 這與汪澤華的研究，豬瘟疫苗引起的精子活力下降至10天后開始恢復(fù)，至14天完全恢復(fù)的結(jié)論不一致[[[]汪澤華.常規(guī)免疫注射對公豬精子活力的影響[J]河北畜牧獸醫(yī).2002,18（3）：19.]]，究其原因，可能是他的研究使用2種以上的滅活疫苗所致。

精子畸形率在3種疫苗同免疫后較免疫前有明顯增高（P＜0.05） 但是均沒有超過畸形率≤20%這一國家標(biāo)準(zhǔn)。

綜上，3種疫苗同時免疫后，公豬精子畸形率明顯增加，大約克采精量明顯下降，究其原因，是因為滅活疫苗生產(chǎn)中加入的氫氧化鋁等佐劑對豬體細(xì)胞的生物毒性引起。所選種公豬在免疫后第28天的抗體檢測中，各品種均表現(xiàn)出了較好的抗體水平是由于免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前前一次免疫抗體存在所致。

根據(jù)(GB23238-2009《種豬常溫精液》 )對用于生產(chǎn)常溫精液的原精液要求是：采精量≥100ml、精子密度≥1億/ml、精子活力≥70%、精子畸形率≤20%，外觀乳白色，無膿性分泌物，無皮毛等異物，結(jié)合本試驗可知在種公豬的免疫上可以采用3種疫苗同時免疫。

5 結(jié)論

豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、豬口蹄疫O型合成肽疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（NVDC-JXA1株） 三種疫苗同時分點免疫種公豬，精子畸形率在免疫后有顯著上升，但精液品質(zhì)符合常溫精液產(chǎn)品要求，并沒有超過國家標(biāo)準(zhǔn)，該方法能有效降低因免疫對精液品質(zhì)造成的不良影響，減少影響頻次，縮短影響周期。在種公豬的免疫上是安全可行的。

[1] 張淑二，林雪，劉棟，等.注射口蹄疫疫苗對不同肉用品種種公牛精液品質(zhì)的影響[J]中國草食動物.2011,31（4）：23-25.

[2]佟敬賓.注射疫苗對種公豬精液品質(zhì)的影響[J]豬業(yè)科學(xué).2008,9:94-95.

[3]汪澤華.常規(guī)免疫注射對公豬精子活力的影響[J]河北畜牧獸醫(yī).2002,18（3）：19.