韓曉燕 汪偉民

·基礎(chǔ)研究·

人臍帶間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及其對大鼠血液指標的影響

韓曉燕 汪偉民

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的體外培養(yǎng)以及其不同濃度對大鼠血液指標的作用。 方法 體外培養(yǎng)hUC-MSCs，將SPF級SD雌性大鼠45只,平均體質(zhì)量為(200±10)g,隨機均分為5組：低、中、高濃度細胞移植組，生理鹽水組，空白對照組，其中，低濃度為(0.5×106/mL)、中濃度為(1×106/mL)、高濃度為(2×106/mL)、生理鹽水組(0.9 % NS)。將培養(yǎng)成功的hUC-MSCs配比成相應(yīng)的濃度，各取1 mL經(jīng)過大鼠尾靜脈輸注到大鼠體循環(huán)內(nèi)，空白對照組不做任何處理；分別按注射后1 d，5 d，10 d時間順序，每次分別隨機抽取5組中1個亞組的大鼠處死以收集腹主動脈內(nèi)血液，檢測其血常規(guī)及生化指標并進行數(shù)據(jù)分析，了解hUC-MSCs對大鼠血常規(guī)、生化指標是否存在影響。 結(jié)果 本實驗通過收集胎兒臍帶成功在體外培養(yǎng)出hUC-MSCs。另將不同濃度的hUC-MSC經(jīng)大鼠尾靜脈輸注大鼠體循環(huán)內(nèi)，血液數(shù)值上得到：① 大鼠白細胞隨hUC-MSCs濃度的升高而升高，且各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其數(shù)值隨時間的改變沒有降低；② 大鼠總膽紅素在1 d后出現(xiàn)增高，低濃度組表現(xiàn)顯著，隨時間推移恢復(fù)正常。 結(jié)論 hUC-MSCs可在體外成功分離培養(yǎng)；經(jīng)大鼠尾靜脈輸注大鼠體循環(huán)內(nèi)，可引起白細胞的升高和總膽紅素的一過性升高。

人臍帶間充質(zhì)干細胞； 體外培養(yǎng)； 尾靜脈注射； 大鼠

眾多骨髓間充質(zhì)干細胞研究結(jié)果表明，因其取材方便，易于分離培養(yǎng)，擴增迅速，多向分化潛能以及具有向損傷處遷移的眾多優(yōu)勢而日益受到人們的關(guān)注[1]，逐步從動物實驗的應(yīng)用轉(zhuǎn)向臨床。研究人員努力實踐其應(yīng)用于臨床的可行性，其中包括多能分化潛力、免疫原性、修復(fù)能力等[2]，并涉入到造血功能重建、心臟系統(tǒng)疾病、免疫風濕改善等各類學科[3-5]。近年來，科研進一步發(fā)現(xiàn)人類臍帶中的間充質(zhì)干細胞增殖數(shù)量遠多于骨髓及外周血[6]，從中分離出人臍帶血間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)更簡易，含量更多[7-9]，并有報道[10，11]，骨髓MSCs隨著年齡的增長數(shù)量將明顯減少，為追求更適宜的間充質(zhì)干細胞來源，人們將重點轉(zhuǎn)移至hUC-MSCs。本文著重探討人臍帶間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及對大鼠的血液指標的影響，并觀察注射后大鼠有無嚴重的排斥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①人臍帶間充質(zhì)干細胞：在無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶組織；②實驗動物：健康SPF級SD雌性大鼠45只，6周齡，體質(zhì)量(200±10)g，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。③實驗試劑：α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco)；水合氯醛(深圳三利化學制品有限公司)；苦味酸(武漢福德化工有限公司)。④實驗儀器及設(shè)備：DK-8D型電熱恒溫水槽(上海躍進醫(yī)療器械廠)； SW-CJ-1ED型凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；BH75-HERA cell 150培養(yǎng)箱(克勒格瓦尼(上海)分析儀器有限公司)；IX70顯微鏡(奧林巴斯)；臺式離心機 LDZ5-2(康源科技)；全自動生化分析儀RL7600D(瑞士羅氏公司)；血常規(guī)分析儀SYMEX XE-2100(日本東亞公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的體外培養(yǎng)及擴增 本實驗hUC-MSCs體外培養(yǎng)的原理是干細胞對培養(yǎng)瓶的較強貼壁能力。在無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)的健康胎兒臍帶組織，2 h內(nèi)用含200 U/mL青、鏈霉素的磷酸緩沖液(PBS PH=7.4)反復(fù)沖洗去除表面的血液成分，用無菌剪刀剔除臍動、靜脈后主要是取臍帶的華爾通膠-又稱臍帶基質(zhì)，在含少量PBS下將臍帶組織切割成體積約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，隨后放入無菌試管中加1% 膠原酶Ⅱ 37℃消化2 h，中間間斷震蕩混勻，再加入2.5% 胰酶 3～5 mL繼續(xù)消化30 min后加入血清3～5 mL終止，用200目過濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織。將過濾液用PBS稀釋，使用臺式離心機以2 500 r/min離心20 min。棄除上層液體，將底層沉淀物再次稀釋，繼續(xù)以2 000 r/min離心20 min，收集離心沉淀細胞，細胞板進行計數(shù)。將分離的細胞調(diào)整密度為5×105/cm2接種于T25的培養(yǎng)瓶中。接種前在培養(yǎng)瓶中加入α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、2 mmol/L谷胺酰胺、5 ng/mL EGF)。置于含有5%～6% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～1.5 h后取出，可見組織細胞已經(jīng)粘附在培養(yǎng)皿底部，沿邊緣緩慢加入DMEM/F12+FBS (不能沖起貼壁組織)，讓培養(yǎng)基緩慢蔓延整個培養(yǎng)體系。48～72 h后細胞換液，去除非貼壁細胞，以后每3天換液1次，換液過程中避免沖擊貼壁細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及克隆形成情況，細胞融合80%～90%后使用2.5%胰酶在37℃下消化1～2 min鏡下觀察hUC-MSCs由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形并從培養(yǎng)瓶底漂浮起來后，加入所用胰酶量的4～5倍(4～5 mL EME培養(yǎng)基)進行終止胰酶對hUC-MSCs的消化, 用無菌移液管將從培養(yǎng)瓶底部消化下來的hUC-MSCs混懸液移至15 mL的離心管中，在1 200 rpm下離心5 min后可見管底少許白色細胞層(即hUC-MSCs), 用無菌移液管移棄上層離心液體并留取白色細胞層，再加入12 mL EME培養(yǎng)基緩慢吹打均勻，以1 ∶2或1 ∶3平均分裝在培養(yǎng)瓶中，鏡下觀察后再將其放至在37℃，5%～6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞總數(shù)達到31.5×106時，調(diào)整好hUC-MSCs濃度，配成低、中、高3個不同濃度組：低劑量(0.5×106/mL)實驗組、中劑量(1×106/mL)實驗組、高劑量(2×106/mL)實驗組。

1.2.2 實驗分組 按隨機分配原則，將45只SD大鼠分為空白對照組(K1)，生理鹽水組(K2)，低、中、高濃度3組(S1、S2、S3)各9只。隨后再將各組隨機分為3個亞組(K11、K12、K13；K21、K22、K23；S11、S12、S13；S21、S22、S23；S31、S32、S33)，每個亞組3只。在不同濃度組的hUC-MSCs中各抽取1 mL hUC-MSCs，經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射各實驗組，同時生理鹽水組將1 mL的0.9% NS經(jīng)尾靜脈注射，注射后用碘伏消毒輸注部位，以防局部感染?？瞻讓φ战M不進行任何注射。將每組大鼠分別用苦味酸在身體不同的部位做標記(低濃度組為右前肢，中濃度組為右后肢，高濃度組為左后肢)，再將大鼠放入鼠籠中，注意保暖、大鼠的飼料(以每只30 g/d供應(yīng)，水隨意供應(yīng))，每天觀察。

1.2.3 標本采集及檢測 按注射后按1 d，5 d，10 d時間順序每次分別隨機抽取5組中1個亞組，將大鼠處死后收集腹主動脈內(nèi)血液10 mL分別放入相應(yīng)試管內(nèi)(血常規(guī)管、生化管)。具體操作步驟如下：①準備好2把無菌鑷子、2把止血鉗、1把手術(shù)刀。10%水合氯醛，以及送檢所需的血常規(guī)、生化試管。②用10%水合氯醛注入大鼠腹腔內(nèi)將大鼠麻醉(水合氯醛的用量為大鼠體質(zhì)量的0.3%)。③用棉線將大鼠的頭部和四肢固定在動物臺上，用手術(shù)刀將大鼠的腹部皮膚打開，再用組織鉗將腹部肌肉逐步打開，直至暴露出腹主動脈和腹主靜脈。④找出腹主動脈后抽取血液，將所需檢查的試管裝至所需量后立即送往實驗室檢查血液生理指標，得出結(jié)果?？偣卜?次將大鼠全部處理完畢。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs體外培養(yǎng) 首次換液前培養(yǎng)瓶內(nèi)有大量懸浮細胞，主要為圓形紅細胞(見圖1a)。首次換液后，可見部分細胞已貼壁，胞體呈圓形或多邊形，漂浮的不貼壁細胞大部分隨換液除去；培養(yǎng)3 d，貼壁細胞胞體明顯增大并開始分裂增殖，細胞形態(tài)漸變?yōu)樗笮位蚣忓N形，呈成纖維細胞樣生長，形成大小不一的集落。7天時，細胞變成長梭形，基本形成明顯克隆，細胞分裂增殖明顯，胞漿豐富，核大，呈橢圓形。在10～14天，培養(yǎng)的細胞長滿培養(yǎng)瓶底的80%～90%并融合，呈漩渦狀或輻射狀排列，細胞變得扁平，胞體狹長，核呈橢圓形。分瓶傳代培養(yǎng)的細胞初始呈圓形，2～4 h貼壁伸展，大多數(shù)細胞呈梭形的成纖維細胞樣形態(tài)，均勻性分布生長，細胞增多匯合呈漩渦狀或輻射狀排列，少數(shù)細胞為三角形、多角形，胞核呈圓形或橢圓形。傳代培養(yǎng)的BMSC在形態(tài)學上更加趨于一致，為成纖維細胞樣(見圖1b)。

2.2 大鼠血液指標分析

2.2.1 大鼠白細胞數(shù)據(jù)分析 hUC-MSCs經(jīng)大鼠尾靜脈輸注至體循環(huán)內(nèi)后，在不同濃度組不同時間點采集大鼠腹主動脈血進行WBC、RBC、PLT、ALT、AST、TBIL、LDH、CPK、BUN測定；將其血液指標采用one-way anova進行數(shù)據(jù)分析。低、中、高3個濃度實驗組之間的WBC數(shù)值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且分別與自生理鹽水組、正常對照組的WBC數(shù)值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白細胞數(shù)值隨濃度增高而增多，隨時間的推移并未減少。見圖2。

2.2.2 大鼠直接膽紅素數(shù)據(jù) 低濃度組較其他各濃度組有明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨時間推移而逐步恢復(fù)正常。見圖3。

3 討論

近年來，間充質(zhì)干細胞在治療細胞、臟器損傷性疾病和器官修復(fù)等方面成為研究熱點，這也為臨床治療提供有利的基礎(chǔ)。而臨床應(yīng)用中最常見的突出問題即是免疫排斥和致瘤性。研究[12-16]表明，間充質(zhì)干細胞僅低表達MCH-Ⅰ而不表達MCH-Ⅱ，并缺乏共刺激分子CD80，CD86和CD40[12]，不能誘導(dǎo)異體或異種淋巴細胞增殖，進而阻斷了抗原識別，抗原呈遞等一系列免疫應(yīng)答，減輕排斥反應(yīng)增加移植成功率，并降低了移植物抗宿主疾病的發(fā)生，同時該細胞無致瘤性。故本實驗利用hUC-MSCs對鼠類進行異種移植,且采用大鼠尾靜脈輸注。經(jīng)過輸注不同濃度hUC-MSCs，在不同時間點觀察相關(guān)血液指標，得出：hUC-MSCs可引起大鼠白細胞增高?？紤]一方面該實驗是異種移植，可能由于種族之間存在炎性應(yīng)激保護自身機體而引起[17]；另一方面大量文獻[18-24]提示干細胞參與機體免疫應(yīng)答，白細胞的增多可能是干細胞免疫答應(yīng)過程的表現(xiàn)，同時雖出現(xiàn)大鼠膽紅素增高，但是根據(jù)統(tǒng)計分析，增高為一過性可自行恢復(fù)正常，對肝臟其他功能指標并未引起異常。通過該結(jié)果也間接證實hUC-MSCs在肝臟內(nèi)發(fā)揮作用，且在體循環(huán)中存活。實驗過程中大鼠在接受靜脈注射后，飲食、活動及生命體征均保持正常，未出現(xiàn)腹瀉、抽搐、死亡等現(xiàn)象，其操作性得到肯定，安全性有待進一步驗證。本實驗經(jīng)過不同的時間點所測得的數(shù)據(jù)，得出：hUC-MSCs可引起大鼠體內(nèi)白細胞的升高和直接膽紅素的一過性升高；其他血液指標未見明顯差異性改變(P>0.05)。另在細胞體外培養(yǎng)傳代的實驗過程中發(fā)現(xiàn)：① hUC-MSCs在37℃，6%的CO2濃度的培養(yǎng)箱中較37℃，5.5%的CO2濃度的培養(yǎng)中生長更加旺盛,CO2的濃度是否對間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)有一定的作用，還需要實驗進一步驗證；② 直接使用2.5%胰酶進行消化貼壁細胞時鏡下觀察，可見hUC-MSCs迅速由梭形變成圓形，即使立即終止消化仍會出現(xiàn)細胞生長延遲或不增；隨后傳代時改用2.5%胰酶加配等量PBS液進行稀釋，細胞生長分裂速度明顯改善?？紤]可能是原濃度胰酶對細胞消化過快，不易掌控終止時間，同時濃度高對干細胞損傷較大，影響細胞貼壁分裂生長。③ 鏡下觀察間充質(zhì)干細胞會大量聚集在培養(yǎng)瓶的兩面交匯處(分裝的每瓶都出現(xiàn)此類現(xiàn)象)，究竟是何原因，有待今后實驗繼續(xù)探討。

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(2015-03-24修稿 2015-06-20修回)

安徽省教育廳自然科學基金資助項目(項目編號：KJ2009A118)

230022 合肥 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部呼吸內(nèi)科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.08.001