黃仁術(shù)　易凡

摘要：為了探討金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）提取液的抑菌效果，試驗(yàn)測(cè)得其乙醇提取液中（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量達(dá)到10.019 mg/mL，占其塊根干物質(zhì)重的1.85%；牛津杯法表明金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均有抑制作用，但對(duì)黑曲霉、灰綠青霉沒(méi)有抑制作用；二倍稀釋法表明（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2.505、5010、5.010 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為5.010 mg/mL。

關(guān)鍵詞：金蕎麥；（-）表兒茶素；體外抑菌

中圖分類號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0308-03

收稿日期：2014-02-18

基金項(xiàng)目：安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012A280）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201210376004）。

作者簡(jiǎn)介：黃仁術(shù)（1976—），女，新疆阿克蘇人，碩士，副教授，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：ahhrs@126.com。植物是抑菌活性物質(zhì)的天然寶庫(kù)，Grange等報(bào)道約有2 400種植物具有防治有害生物的活性[1]。金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）作為一種具有開(kāi)發(fā)前途的資源植物，目前有關(guān)其抑菌方面的研究較少，且未涉及具體的抗菌活性物質(zhì)成分。如有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道金蕎麥乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、沙門氏菌等有抑制作用[2-5]；而陳福勇等發(fā)現(xiàn)金蕎麥乙醇提取物對(duì)雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制作用[6]；張永仙等則報(bào)道金蕎麥乙醇提取物對(duì)豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬與雞的致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、豬鏈球菌、克氏肺炎球菌等幾乎無(wú)抗菌作用，但在體內(nèi)卻有明顯的抗感染作用[7]。實(shí)際上，金蕎麥乙醇提取物為一類含原花色素的縮合性單寧混合物，主要由（-）表兒茶素及其二聚體組成，其中（-）表兒茶素單元的含量占65%～70%[8]。為此，本研究對(duì)金蕎麥乙醇提取物——（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，并在此基礎(chǔ)上確定其對(duì)一些代表性細(xì)菌和真菌的抗菌效果，從而為無(wú)殘留、無(wú)毒副作用及細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

金蕎麥采集于安徽省潛山縣；（-）表兒茶素純度為98% （中國(guó)藥品生物制品檢定所）；試驗(yàn)菌株包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性細(xì)菌和真菌，其中革蘭陽(yáng)性細(xì)菌以金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表，革蘭陰性菌以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表，真菌以黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）、釀酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）為代表；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基。

1.2儀器設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），202-1型電熱恒溫干燥箱（上海浦東英豐科學(xué)儀器有限公司），HH-2/HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），YX-450電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司），PYX-150HA恒溫恒濕培養(yǎng)箱（科立儀器），SW-CJ-1C潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的提取與測(cè)定建立香莢蘭素-鹽酸分光光度法對(duì)（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：D=0.226 2C-0.012 6，R=0999 3，其中，D為吸光度，C為測(cè)定液濃度（μg/mL）。稱取20.0 g金蕎麥根部粉碎物，70%乙醇浸泡24 h，提取物用布氏漏斗抽濾提取得到上清液，上清液繼續(xù)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮提取液，直至冷凝裝置不再有液體滴出，倒出提取液，量出為37 mL，封口冷藏保存。提取液測(cè)定時(shí)，用移液槍取10 μl提取液和10 mL乙醇于50 mL容量瓶中，用1%香莢蘭-濃鹽酸定容，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定液中（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的濃度[9]，試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2供試菌株的復(fù)蘇與純化無(wú)菌條件下用接種環(huán)接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng) 1 d。接種釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉于PDA培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。再用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種培養(yǎng)，如此重復(fù)4次，得到純種菌體。用接種鏟刮下純種菌體，無(wú)菌水稀釋備用。

1.3.3牛津杯法測(cè)定（-）表兒茶素類活性物質(zhì)抑菌效果在倒好的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上分別加入100 μL金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌菌液，在PDA培養(yǎng)基上分別加入100 μL釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉菌液，涂抹均勻。用鑷子夾取已經(jīng)滅菌的牛津杯置于平板中央，用已滅菌的移液槍移取200 μL濃縮物加入牛津杯中。細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃條件細(xì)培養(yǎng)3 d，觀察并測(cè)量抑菌圈。

1.3.4（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC測(cè)定每組取滅菌小試管10支，按照1～10編號(hào)，細(xì)菌每管加入牛肉膏湯1 mL，真菌每管加入馬鈴薯葡萄糖液1 mL；采用二倍稀釋法，用吸管吸取提取液 1 mL放入第1管，并反復(fù)吹勻；接著從第1管吸出1 mL放入第2管同樣吹勻后吸出1 mL放入第3管，依次逐管進(jìn)行稀釋到第8管；然后各管加入0.5 mL供試菌菌液。第9管為加入1 mL提取液但不加菌液的陰性對(duì)照管，第10管為不加提取液只加0.5 mL供試菌菌液的陽(yáng)性對(duì)照管。細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)各管菌液生長(zhǎng)情況測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）。endprint

進(jìn)一步將未見(jiàn)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的各試管內(nèi)的培養(yǎng)液移種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基上，細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落生長(zhǎng)情況測(cè)定最小殺菌濃度（MBC）。

2結(jié)果與分析

2.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的含量

由表1可見(jiàn)，金蕎麥的乙醇提取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，其（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量達(dá)到10.019 mg/mL，總提取量占其塊根干物質(zhì)質(zhì)量的1.85%。

表1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量測(cè)定情況

重復(fù)測(cè)定液吸光度測(cè)定液中活性物質(zhì)

含量（μg/mL）提取液中活性物質(zhì)

含量（mg/mL）Ⅰ0.4391.9969.982Ⅱ0.440 2.00110.004Ⅲ0.443 2.01410.071平均0.4412.00410.019

2.2（-）表兒茶素類 活性物質(zhì)抑菌效果

由圖1可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)在10.019 mg/mL濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均形成抑菌圈，表明有明顯的抑菌作用；但對(duì)黑曲霉、灰綠青霉沒(méi)有形成抑菌圈，表明沒(méi)有抑菌作用。進(jìn)一步測(cè)量表明，相同濃度下，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)上述菌群的抑菌圈直徑為：金黃色葡萄球菌>釀酒酵母>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌（表2）。

2.3（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC

從表3中可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.252 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為5.010 mg/mL；對(duì)大腸桿菌的MIC為 2.505 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC為 5.010 mg/mL。

3討論

金蕎麥乙醇提取物原液——（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量在10.019 mg/mL濃度時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌有抑菌作用，對(duì)黑曲霉、灰綠青霉沒(méi)有抑制作用。（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2505、5.010、5.010 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為5010 mg/mL；因提取液原液的濃度關(guān)系，未測(cè)定出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MBC。金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的抑菌活性不同，主要原因是活性成分對(duì)不同菌種的菌絲或孢子的生長(zhǎng)抵制能力不同所致[10]。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果與前人對(duì)金蕎麥乙醇提取物的抑菌情況報(bào)道不一，可能與提取液中的活性物質(zhì)濃度不同相關(guān)。

香莢蘭素比色法測(cè)定（-）表兒茶素時(shí)，所測(cè)物質(zhì)應(yīng)包括（-）表兒茶素、（+）兒茶素，以及二者的二聚體和沒(méi)食子酸酯等（-）表兒茶素類物質(zhì)總含量[11]。此類含原花色素的縮合性單寧混合物可以通過(guò)結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，聚集細(xì)胞脂質(zhì)，以及單寧自氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫，干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)一步改變細(xì)菌細(xì)胞壁脂肪酸的組成，從而減緩細(xì)菌的生長(zhǎng)[12]。

表2金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對(duì)供試菌的抑菌圈的影響

供試菌抑菌圈直徑（mm）金黃色葡萄球菌13枯草芽孢桿菌10釀酒酵母12大腸桿菌9黑曲霉-灰綠青霉-注：“-”表示未見(jiàn)明顯抑菌圈。

表3金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC

參考文獻(xiàn)：

[1]Grange M，Ahmed S. Handbook of plant with pest control properties[M]. New York：John Wiley & Sons INC，1988：41.

[2] 中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：629-632.

[3]馮黎莎，陳放，白潔. 金蕎麥的抑菌活性研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2006，24（3）：240-244.

[4]艾群，王斌，王國(guó)清. 金蕎麥制劑的抑菌研究[J]. 黑龍江醫(yī)學(xué)，2002，26（9）：666.

[5]周玉巖，喬紅杰，李春玲，等. 金蕎麥提取物體外抗菌活性研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009（5）：44-46.

[6]陳福勇，甘孟侯，何靜榮，等. 金蕎麥對(duì)幾種致病菌的體外抑菌作用[J]. 中獸醫(yī)學(xué)雜志，1987（4）：5-7.

[7]張永仙，王權(quán). 金蕎麥有效成分的抗菌抗感染作用[J]. 云南畜牧獸醫(yī)，1996（2）：22.

[8]姚榮成，黃梅芬，吳友仁，等. 云南產(chǎn)金蕎麥根莖抗腫瘤有效部位的化學(xué)研究[J]. 云南植物研究，1989，11（2）：215-218.

[9]黃仁術(shù)，王得勝，何曉梅，等. 分光光度法測(cè)定金蕎麥（-）表兒茶素含量的方法研究[J]. 中國(guó)野生植物資源，2012，31（3）：36-39.

[10]馮黎莎，付先龍，陳放，等. 金蕎麥提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性初探[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，43（3）：688-691.

[11]黃仁術(shù)，尹汪斌，何曉梅，等. 乙醇提取金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的工藝[J]. 生物加工過(guò)程，2011，9（4）：35-40.

[12]劉秀麗.植物縮合單寧對(duì)大腸桿菌的抑制作用及抑菌機(jī)理的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.羅明華，張盧水，阮期平，等. 四川省不同種質(zhì)金銀花綠原酸含量的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：311-313.endprint