石春花， 石明雋， 王圓圓， 劉麗榮， 張昌志， 李 霜， 肖 瑛， 嚴 瑞， 郭 兵

(貴陽醫(yī)學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

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MG132對高糖條件下腎小管上皮細胞SnoN蛋白表達及纖維化效應的影響*

石春花， 石明雋△， 王圓圓， 劉麗榮， 張昌志， 李 霜， 肖 瑛， 嚴 瑞， 郭 兵

(貴陽醫(yī)學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

目的： 觀察蛋白酶體抑制劑MG132對高糖培養(yǎng)條件下腎小管上皮細胞核轉錄共抑制因子SnoN蛋白表達的影響，探討MG132減輕高糖狀態(tài)下腎小管纖維化病變的作用及可能機制。方法：將體外培養(yǎng)的NRK-52E細胞分為正常組(NG)、高糖組(HG)和不同濃度MG132預處理后高糖培養(yǎng)組(HG+MG132)，采用免疫熒光雙染的方法觀察E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在腎小管上皮細胞中的表達和分布，用Western blotting方法檢測SnoN、Samd泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)等目標蛋白的相對表達量。結果：與 NG組相比，HG組腎小管上皮細胞E-cadherin和SnoN表達減少(P<0.05)，而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表達增多(P<0.05)；與HG組相比，不同濃度MG132預處理腎小管上皮細胞后高糖培養(yǎng)，可見腎小管上皮細胞中SnoN和E-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達顯著下調(diào)(P<0.05)，并且這種效應呈量效依賴性，但MG132預處理對Smurf2和Arkadia的表達無影響。結論：MG132可對抗高糖介導的腎小管上皮細胞的纖維化效應，其機制可能是通過減少SnoN蛋白的泛素化降解作用實現(xiàn)的。

腎小管上皮細胞； 高糖； MG132； SnoN蛋白； Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2； Arkadia蛋白

轉化生長因子β1(transformation growth factor-β1，TGF-β1 )/Smad信號通路是目前公認的與腎間質纖維化密切相關的信號通路[1]。轉錄共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein)可通過多種途徑嚴密地控制著TGF-β1/Smad信號通路的活化水平[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠腎小管上皮細胞中的SnoN蛋白表達減少可能參與了糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生發(fā)展[3]。SnoN蛋白顯著減少的機制可能與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2，Smurf2)和Arkadia等E3泛素連接酶介導其泛素化降解有關[3-5]。Smurf2和Arkadia屬于泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的靶蛋白特異性識別者，可能通過誘導SnoN的泛素化降解從而起到增強TGF-β/Smad信號通路的作用[6]，但具體作用機制有待進一步闡明。MG132具有抑制蛋白酶復合體的活性，進而抑制靶蛋白的降解[7]。因此，本研究采用MG132預處理腎小管上皮細胞后高糖培養(yǎng)，通過抑制蛋白酶體對SnoN蛋白的泛素化降解，進一步研究SnoN在DN病程中的可能作用，并探討MG132治療腎小管-間質纖維化的機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

大鼠腎小管上皮細胞株NRK-52E(復旦大學陸利民教授惠贈)； trypsin胰蛋白酶消化液、兩步法免疫組化檢測試劑、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物技術有限公司)；I抗稀釋液、ECL顯色劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)、牛血清白蛋白、免疫熒光試劑盒-抗兔FITC、免疫熒光試劑盒-抗小鼠Cy3、Western blotting試劑、IP細胞裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天公司)；DAB顯色試劑盒(博士德公司)；PVDF膜、低糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶蛋白、青霉素和鏈霉素(Hyclong)；胎牛血清(Gibco)；MG132 (Sigma)；rabbit-anti-SnoN、goat-anti-Arkadia、rabbit-anti-E-cadherin(Santa Cruz);mouse-anti-α-SMA、 rabbit-anti-FN、rabbit-anti-Col-I和mouse-anti-β-actin(博奧森公司)；rabbit-anti-Smurf2(Abcam)。其余試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 NRK-52E細胞株培養(yǎng)和處理 將狀況良好的NRK-52E分為細胞正常對照組(NG)：予以0.12‰ DMSO加入DMEM+2% 胎牛血清培養(yǎng)3 h后，換DMEM+2% 胎牛血清培養(yǎng)48 h；高糖對照組(HG)：予以含0.12‰的DMSO加入DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)3 h后，換19.5 mmol/L的D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)培養(yǎng)48 h；高糖MG132處理組(HG+MG132)：以DMSO為溶劑，使MG132終濃度分別為1 μmol/L、2 μmol/L和5 μmol/L，加入DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)3 h后，換19.5 mmol/L的D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)48 h。

2.2 細胞免疫熒光間接雙染 將NRK-52E細胞接種至鋪有22 mm×22 mm蓋玻片的6孔板中，融合度達70%后靜止細胞使其同步化生長，PBS漂洗、細胞固定液固定、5% BSA封閉，予E-cadherin(1∶200)和α-SMA(1∶100) 特異性抗體孵育過夜，復溫、漂洗，按試劑盒操作指南避光孵育熒光Ⅱ抗及DAPI，漂洗后蓋上載玻片，用OLYPUMS-DP72倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2.3 Western blotting檢測目的蛋白 吸取細胞培養(yǎng)液，生理鹽水清洗2次，吸干，6孔板每孔加入含PMSF的細胞裂解液100 μL，用細胞刮刀刮取細胞蛋白。充分裂解后收集到EP管中，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，取相應量的上清和2×SDS樣本緩沖液配制成統(tǒng)一濃度蛋白樣品，混勻后在100 ℃加熱10 min，保存于-20 ℃待用，每次用前煮沸3 min，上樣、電泳、轉膜、封閉，分別孵育特異性抗體過夜，分別為SnoN(1∶200)、Smurf2(1∶600)、Arkadia (1∶300)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶150)、Col-Ⅰ(1∶200)和β-actin(1∶400)，TBST洗膜5 min×3次，孵育特定Ⅱ抗1 h，洗膜后ECL顯影曝光，以檢測各目標蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，通過方差齊性檢驗，進一步多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 NRK-52E細胞中E-cadherin和α-SMA的表達和分布

NRK-52E細胞在正常糖環(huán)境培養(yǎng)下，細胞胞漿中E-cadherin表達較多，而α-SMA表達極少；相反，在高糖環(huán)境培養(yǎng)48 h后，E-cadherin表達明顯減少，而α-SMA表達增多，見圖1。

Figure 1.Immunofluorescence staining of E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells after 48 h incubated with high concentration of glucose (×200). DAPI staining (blue) represents cell nucleus.

2 MG132對NRK-52E細胞SnoN蛋白表達的影響

與NG組相比，HG組NRK-52E細胞中的SnoN蛋白表達顯著減少(P<0.05)；而隨著 MG132預處理濃度的增高，HG+MG132組的SnoN蛋白表達較HG組逐漸增多，差異顯著(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖2。

Figure 2.The effects of MG132 on the protein expression of SnoN in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group; △P<0.05 vs HG group; #P<0.05 vs 5 μmol/L MG132+HG group.

3 MG132對高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞Smurf2和Arkadia蛋白表達的影響

HG組NRK-52E細胞中的Smurf2和Arkadia蛋白表達較NG組顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而MG132預處理對高糖環(huán)境培養(yǎng)的NRK-52E細胞中的Smurf2和Arkadia蛋白表達沒有影響，見圖3。

Figure 3.The effects of MG132 on the protein expression of Smurf2 and Arkadia in NRK-52E cells incubated under different conditions. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group.

4 MG132對高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅰ表達的影響

與NG組比較，高糖顯著增加了NRK-52E細胞中α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達，并降低了E-cadherin表達(P<0.05)；隨著MG132濃度的增高，各HG+MG132組NRK-52E細胞中α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達較HG組顯著減少，而E-cadherin蛋白的表達顯著增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并呈量效依賴性，見圖4。

Figure 4.The effects of MG132 on the protein expression of E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅰ in NRK-52 E cells under different conditions. Western blotting was used to determine the expression of E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅰ. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group; △P<0.05 vs HG group; #P<0.05 vs 1 μmol/L MG132+HG group; ▲P<0.05 vs 2 μmol/L MG132+HG group.

討 論

DN是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者主要的死亡原因，其發(fā)病機制尚未充分闡明，且目前缺乏有效治療措施。隨著對DN發(fā)病機制研究的深入，腎小管纖維化在其中的作用日益被重視。腎小管上皮細胞向間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是腎間質纖維化發(fā)生的重要原因[8]。本研究結果顯示，高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞48 h后，腎小管上皮細胞標志性蛋白E-cadherin的表達顯著減少，間充質細胞標志性蛋白α-SMA的表達明顯增多，并伴有Col-Ⅰ的高表達，表明高糖誘導NRK-52E細胞發(fā)生了EMT，同時合成和分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)。

研究表明，高糖能刺激多種細胞因子的分泌和激活，其中，TGF-β1是目前已證實的致腎小管EMT最強的細胞因子之一，在DN腎組織及高糖刺激的腎小管上皮細胞中TGF-β1表達都顯著上調(diào)，通過TGF-β1/Smads信號通路誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，進而導致腎小管間質纖維化發(fā)生[1, 8]。SnoN作為TGF-β1/Smads信號通路的重要負調(diào)控因子，可通過多種機制嚴密地控制著TGF-β1/Smads信號通路激活[4]，故SnoN的表達水平在很大程度上影響TGF-β1的生物學效應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著DN病程的進展，腎小管上皮細胞中SnoN蛋白的表達顯著減少，TGF-β1、Smad2/3及 Smurf2的表達持續(xù)增多，但SnoN mRNA較正常組卻無明顯差異，故推測DN病程中SnoN蛋白的減少可能是由于Smurf2等E3泛素連接酶介導其泛素化降解的結果[5, 9]，而不是由轉錄水平的下調(diào)引起的。也有研究發(fā)現(xiàn)，體外高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中SnoN蛋白的表達減少，E3泛素連接酶Arkadia的表達增高[10]，在阻塞性腎病模型中SnoN蛋白隨著病程進展顯著減少， E3泛素連接酶Smurf2的表達增多[4]，均表明SnoN蛋白的表達下調(diào)可能與泛素-蛋白酶體激活有關。本研究結果顯示，高糖條件下NRK-52E細胞中Smurf2和Arkadia的表達增多，而SnoN蛋白的表達則顯著減少。結合我們課題組和其他學者的研究結果[5, 10]，進一步提示SnoN蛋白的減少可能是由于泛素-蛋白酶體激活增強對其泛素化降解所致。由于SnoN的減少，失去了對TGF-β1/Smads信號通路的控制，使其致纖維化效應級聯(lián)放大[4-5, 10]， E-cadherin表達下調(diào)，α-SMA和Col-Ⅰ表達增多，促進了腎小管間質纖維化的發(fā)生發(fā)展。而通過上調(diào)SnoN蛋白的表達，能夠抑制TGF-β1/Smads信號通路介導α-SMA、FN等靶基因的表達[4]，減輕纖維化病變。因此，恢復內(nèi)源性SnoN蛋白表達水平成為防治DN的研究重點。

MG132是一種醛基肽類化合物的蛋白酶體抑制劑，能與蛋白酶體結合，可逆性地抑制蛋白酶體的活性，進而抑制靶蛋白的降解[7]。近年研究證實，MG132可通過多種途徑抑制心、肺等臟器纖維化的發(fā)生[11-12]，尤其在對抗氧化損傷、炎癥浸潤、纖維化病變方面具有較好作用[13-14]。鑒于DN病程中SnoN蛋白表達減少可能是由于泛素-蛋白酶體活性增強對其降解所致，所以我們設想：是否可通過抑制蛋白酶體系統(tǒng)的活性，減少SnoN蛋白的降解，從而延緩或逆轉DN纖維化進程。因此，本研究予不同濃度MG132預處理NRK-52E細胞后高糖培養(yǎng)，結果顯示MG132能顯著對抗高糖誘導的SnoN蛋白降低，恢復NRK-52E細胞中SnoN蛋白的表達，并使E-cadherin蛋白表達上調(diào)，而α-SMA、FN和Col-Ⅰ蛋白表達下調(diào)，而且這種效應呈量效依賴性。但是，MG132對高糖條件下腎小管上皮細胞的Smurf2和Arkadia表達水平?jīng)]有影響。上述研究結果表明，MG132恢復高糖條件下腎小管上皮細胞中SnoN蛋白的表達不是通過減少E3泛素連接酶Smurf2和Arkadia的表達水平，而是通過抑制蛋白酶體對SnoN蛋白的降解，恢復內(nèi)源性SnoN蛋白表達，進而在胞漿和胞核發(fā)揮限制TGF-β1/Smads信號轉導的作用，延緩或阻斷DN腎小管EMT的發(fā)生和ECM的合成，進而抑制了腎小管間質纖維化的發(fā)生發(fā)展。

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Effects of MG132 on protein expression of SnoN and fibrosis- related indicators in NRK-52E cells after incubated with high concentration of glucose

SHI Chun-hua, SHI Ming-jun, WANG Yuan-yuan, LIU Li-rong, ZHANG Chang-zhi, LI Shuang, XIAO Ying, YAN Rui, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:smjtyf@126.com)

AIM: To investigate the effects of proteasome inhibitor MG132 on the expression of SnoN in renal tubule epithelial cells incubated in high glucose, and to explore the possible mechanism and function that MG132 reduces or slows down renal tubular interstitial injury after incubated in high glucose. METHODS: The NRK-52E cells were divided into normal control group (NG), high glucose group (HG) and high glucose plus pretreatment with different doses of MG132 group (HG+MG132). The immunofluorescence staining was used to detect the protein expression of E-cadherin and α-smooth muscle actin (α-SMA) in NRK-52E cells under different conditions. The relative protein expression levels of SnoN, Smad ubiquitination regulatory factor 2 (Smurf2), Arkadia, E-cadherin, α-SMA and collagen type Ⅰ(Col-Ⅰ) were detected by Western blotting. RESULTS: Compared with NG group, the expression of E-cadherin and SnoN was decreased (P<0.05), while the expression of α-SMA, Col-Ⅰ, Smurf2 and Arkadia was increased (P<0.05). Compared with HG group, the protein expression of SnoN and E-cadherin was significantly up-regulated in HG+MG132 group (P<0.05), and the protein expression of α-SMA and Col-Ⅰ was significantly down-regulated in a dose-depended manner (P<0.05). However, no effect on the protein expression of Smurf2 and Arkadia was observed. CONCLUSION: MG132 inhibits the degradation of SnoN protein induced by high glucose, thus reducing the renal fibrosis.

Renal tubular epithelial cells; High glucose; MG132; SnoN protein; Smad ubiquitination regulatory factor 2; Arkadia protein

1000- 4718(2015)01- 0064- 05

2014- 08- 12

2014- 10- 08

國家自然科學基金資助項目(No.81160094)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項基金資助項目(黔省專合字[2010]40號)；貴陽醫(yī)學院青年基金資助項目(No. k2007-13)

△通訊作者 Tel: 0851-6908348; E-mail: smjtyf@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.013