史純珍，張紅漫，李 霜，黃 和

（1.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，環(huán)境科學(xué)與工程系，北京100048；2.南京工業(yè)大學(xué) 生命與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京210000）

1 引言

富馬酸又名反丁烯二酸、延胡索酸，是一種重要化工原料，被廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。作為一種四碳平臺化合物，可進(jìn)一步合成多種高價(jià)值衍生物。米根霉是發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的高產(chǎn)菌株，本文利用HPLCUV建立了米根霉胞內(nèi)6種能荷物質(zhì)的檢測方法，為研究米根霉產(chǎn)富馬酸胞內(nèi)代謝途徑提供方法平臺。

ATP、NADH、NAD為微生物代謝過程中時刻處于變化的物質(zhì)，同時也是對生理活性影響較大的代謝產(chǎn)物，能荷物質(zhì)的含量水平是微生物生理代謝中的重要考察依據(jù)[1～3]。因此是驗(yàn)證提取方法的高效性及穩(wěn)定性的最佳內(nèi)標(biāo)物[4～6]。通過考察樣品制備過程中胞內(nèi)不穩(wěn)定化合物的回收率，可以作為判斷樣品制備方法優(yōu)劣的可靠標(biāo)準(zhǔn)。對三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）這6種能荷物質(zhì)建立檢測方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

HPLC 戴安系列（P680HPLC Pump System，Chromeleon工作站，紫外檢測器 （UV））（美國戴安公司）；Eppendorf 5804R臺式冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KH2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（中國昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；PHS－3C型精密pH值計(jì)（中國上海雷磁儀器廠）；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Centrifuge 580R 低溫離心機(jī)（Eppendorf）；MDF－U32V超低溫冰箱－80℃（SANYO）。

2.2 色譜分離條件

色譜柱：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反相色譜柱。流動相：以A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)pH值到6.6）；B甲醇，作為流動相，梯度洗脫；室溫25℃，流速1.0mL／min，紫外檢測器（檢測波長254nm）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)品混合溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取一定量的色譜純ATP、ADP、AMP、NAD、NADH和cAMP，用超純水配置成濃度均為1g／L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，逐級稀釋為0.5g／L、0.1g／L、0.05g／L、0.01g／L、5mg／L、1mg／L、0.5mg／L、0.1mg／L、0.05mg／L的濃度。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

日內(nèi)精密度：從同一個搖瓶中取2個平行樣品，經(jīng)過處理后，將2個樣品溶液分別檢測6次。日間精密度：從同一個搖瓶中取2個平行樣品，經(jīng)過處理后，將2個樣品分別連續(xù)3d每一天進(jìn)樣一次。樣品溶液不用時需保存在－20℃下。

2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確配置50mg／L、5mg／L、0.5mg／L三個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入樣品溶液中，測定5種物質(zhì)的回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 初始分離條件的選擇

ATP、ADP、AMP、NAD、NADH 和cAMP屬于低聚核苷酸，為離子樣品，檢測低聚核苷酸最常用最簡便的方法是使用高效液相色譜法[7]。本文使用反相高效液相色譜法，由于低聚核苷酸在反相色譜柱上的保留較小，因此需要加入離子對試劑使其保留增強(qiáng)，測定低聚核苷酸常用的離子對試劑是三乙胺[8]，質(zhì)子化的三乙胺作為有效的離子對試劑能夠?qū)㈦婋x的低聚核苷酸很牢固的結(jié)合在填料柱上。加入離子對試劑后，離子樣品的分離選擇性發(fā)生了很大變化，最大保留出現(xiàn)在高pH值區(qū)（樣品完全解離），又由于色譜柱的固定相長時間在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，因此，pH選擇在中性條件下。流動相中的有機(jī)相常用的為甲醇和乙腈，甲醇毒性較小，因此選用甲醇作為有機(jī)相。

3.2 流動相中H3PO4摩爾濃度的條件優(yōu)化

在初始的分離條件下，流動相的水相分別配置含有H3PO4濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液，然后加入三乙胺使pH值達(dá)到6.6。隨著流動相中H3PO4濃度的增加，6種物質(zhì)在色譜柱上的保留增強(qiáng)，保留時間延長，且在H3PO4濃度為0.6%的時候，6種物質(zhì)之間的分離度最大，且達(dá)到基線分離（R＞1.5），因此選擇H3PO4濃度為0.6%。出峰順序分別為NAD，AMP，ADP，ATP，cAMP，NADH。

圖1為在此優(yōu)化條件下，對6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行分離的液相色譜圖。由圖1A可以看出6種物質(zhì)在30min內(nèi)全部實(shí)現(xiàn)基線分離。圖1B為實(shí)際樣品的分離圖譜，除AMP與ADP以外，其余4種物質(zhì)也都實(shí)現(xiàn)了基線分離，并且AMP與ADP的峰形不影響峰面積的積分。因此，用離子對色譜法檢測分離6種物質(zhì)的最佳檢測條件是：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反向色譜柱，A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)pH 值到6.6）；B甲醇作為流動相，10%B保持洗脫10min，然后以3%B／min速度增至25%，室溫，流速1.0mL／min，紫外檢測器（波長254nm）。

圖1 6種能荷物質(zhì)混合物的分離圖譜

3.3 外標(biāo)工作曲線的線性

在標(biāo)品與樣品進(jìn)樣量相同的情況下，用外標(biāo)法定量。準(zhǔn)確吸取不同濃度的ATP，ADP，AMP，NADH，NAD，cAMP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL分別進(jìn)樣，測定其峰面積，以峰面積A對濃度C（g／L）作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及檢測限和定量限見表1。

從表1中可以看出，6種物質(zhì)在該檢測條件下可以得到較好的線性，相關(guān)系數(shù)在0.9978～0.9995之間。檢測限（S／N﹥3）低于0.2166mg／L，檢測靈敏度較高，可用于快速檢測。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)

3.4 方法的回收率和重復(fù)性試驗(yàn)

用實(shí)際樣品（胞內(nèi)提取液）進(jìn)行檢測，根據(jù)上述方法對檢測方法的精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，6種物質(zhì)的精確度都滿足實(shí)驗(yàn)要求。NADH的日內(nèi)精密度較小，為10.36%，這可能是由于其本身不穩(wěn)定，易分解，還有一個原因，是因?yàn)镹ADH相較于其他五種物質(zhì)而言，本身的響應(yīng)值較?。ǚ迕娣e較?。虼司芏容^小，但是該精密度也可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 回收率測定結(jié)果

由表3中回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，回收率在77.2%～105.2%，因此該檢測方法的準(zhǔn)確度較高。

3.5 米根霉發(fā)酵液樣品中各物質(zhì)的定量分析結(jié)果

取米根霉發(fā)酵第72h的發(fā)酵液，取3個平行樣，在上述分離條件下進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見表4。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看，該方法能夠準(zhǔn)確的測定米根霉胞內(nèi)提取液中各物質(zhì)的含量。

4 結(jié)語

（1）采用離子對液相色譜的方法，可以準(zhǔn)確檢測米根霉胞內(nèi)提取液中 ATP，ADP，AMP，NADH，NAD，cAMP的含量。該方法的最優(yōu)檢測條件是：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反相色譜柱，以 A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)pH到6.6）；B甲醇，作為流動相，梯度洗脫；室溫（25℃），流速1.0mL／min，紫外檢測器（檢測波長254nm）。

表4 不同批次間的樣品檢測結(jié)果

（2）本方法具有干擾小、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，該方法的建立，為研究后續(xù)的淬火和提取方法提供了可靠的依據(jù)，對代謝組學(xué)的整體研究具有重要意義。

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