龍亞飛　王嘯　邱樹毅　等

摘要：為研究農(nóng)用多抗霉素對來自山東、安徽、河南的3株萊氏野村菌的抑菌效果。采用生長速率法測定多抗霉素對萊氏野村菌的EC50值，并通過EC50值進(jìn)行抑菌效果對比。結(jié)果表明：多抗霉素對3株萊氏野村菌都有抑制效果，其中對來自山東的萊氏野村菌Nr13的抑制效果最佳，EC50值為0.437 7 mg/mL。

關(guān)鍵詞：生物農(nóng)藥；萊氏野村菌；多抗霉素；生長速率法；抑菌效果；耐藥性

中圖分類號(hào)： S482.2+8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0144-02

收稿日期：2014-08-30

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號(hào)：黔科合J字[2012]2101號(hào)）。

作者簡介：龍亞飛（1987—），女，穿青族，貴州畢節(jié)人，碩士，主要從事發(fā)酵與制藥的研究。E-mail：1067724485@qq.com。

通信作者：王嘯，副教授，主要從事農(nóng)藥學(xué)的研究。E-mail：wangzi8903@126.com。長期、大量施用化學(xué)殺菌劑不僅會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境，而且還會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低防治效果，因此關(guān)于生物防治的研究引起了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。多抗霉素是一種廣譜抗生素，能干擾真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的生物合成[3]，從而抑制真菌生長；主要用于防治煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病及番茄葉霉病等多種真菌病害。萊氏野村菌（Nomuraea rileyi，簡稱Nr）為昆蟲的重要病原真菌[4]。在研究化學(xué)農(nóng)藥對蟲生真菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及分生孢子產(chǎn)生量時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟲生真菌與殺蟲劑的相容性優(yōu)于殺菌劑[5]。譚可欣用病原真菌菌塊進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，新多抗霉素對煙草赤星病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌都具有很強(qiáng)的抑菌活性，其EC50值分別為0.39、0.43 mg/L[6]；奉代力等采用生長速率法測得10%多抗霉素B 可濕性粉劑對番茄灰霉病菌的EC50值為6.32 mg/L[7]；蔣婧婧通過對萊氏野村菌分生孢子的抑制性試驗(yàn)，篩選出2種藥物對萊氏野村菌的最佳抑制濃度，其中潮霉素B的最佳抑制濃度為80 μg/mL，苯菌靈的最佳抑制濃度為2 μg/mL[8]。姜興印采用孢子萌發(fā)法和生長速率法分別測定試驗(yàn)藥劑對15個(gè)木霉菌株的抗性水平，求出每種藥劑對不同木霉的毒力EC50值，通過EC50值比較不同木霉菌株對試驗(yàn)藥劑的抗性程度[9]。

由于目前對萊氏野村菌耐農(nóng)用抗生素多抗霉素的研究較少，因此本研究采用菌絲生長速率法研究農(nóng)用多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的抑菌效果，篩選出耐多抗霉素的萊氏野村菌，這樣多抗霉素可以殺死其他真菌而使萊氏野村菌不受影響，多抗霉素和萊氏野村菌孢子復(fù)配后施用可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)殺菌殺蟲的目的，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，緩解化學(xué)防治對環(huán)境的壓力。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株由Nr13、Nr19、Nr41安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蟲生真菌菌種保藏庫提供，由貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，具體情況見表1。

表1供試菌株的寄主及來源

菌株代號(hào)寄主來源地Nr13菜粉蝶（Pieris rapae）山東平陰孝直Nr19小菜蛾（Plutella xylostella）安徽繁昌Nr41鱗翅目（Lepidoptera）幼蟲河南南陽

1.2供試藥劑

供試藥劑為3%多抗霉素水劑（安徽省績溪縣農(nóng)華生物科技有限公司）。

1.3供試培養(yǎng)基及菌株預(yù)培養(yǎng)

薩氏麥芽酵母膏（SMAY）培養(yǎng)基：40 g麥芽糖、10 g蛋白胨、20 g酵母膏、20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL。用含0.05%吐溫-80的無菌水配制一定濃度的萊氏野村菌孢子菌懸液，將其涂布于SMAY培養(yǎng)基上，25 ℃下光照培養(yǎng)5～6 d，待菌落邊緣長大量菌絲而沒有產(chǎn)孢時(shí)，即可用于試驗(yàn)。

1.4方法

采用生長速率法測定抑菌效果[10-11]。根據(jù)3%多抗霉素在田間施用時(shí)的稀釋劑量，將藥劑配制成0.6、1.2、1.5、23 mg/mL等5個(gè)濃度梯度。在無菌條件下，用無菌水將多抗霉素分別稀釋1.5、2.0、2.5、5.0、10.0倍。隨后用移液槍吸取10 mL藥液加入含90 mL冷卻至50 ℃左右的SMAY培養(yǎng)基的三角瓶里，充分搖勻后迅速倒入4個(gè)滅菌培養(yǎng)皿（直徑為 9 cm） 中，制成各系列濃度的含藥SMAY培養(yǎng)基平板，以含等量無菌水的SMAY培養(yǎng)基平板為對照；待凝固后，用打孔器（直徑5 mm）打取生長整齊一致的菌餅，菌絲面朝上接種于各含藥培養(yǎng)基中央。25 ℃光照培養(yǎng)10 d，用十字交叉法測定各處理的菌落直徑，3次重復(fù)，取平均數(shù)，計(jì)算相對抑制率。

抑制率=（A-C）-（B-C）A-C×100%。

式中：A表示對照菌落直徑，mm；B表示原菌直徑，mm；C表示處理菌落直徑，mm。

1.5數(shù)據(jù)處理

用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[12]，以試驗(yàn)中設(shè)定的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑制率的概率為縱坐標(biāo)（y），確定各藥劑對病菌的毒力回歸方程y=ax+b、相關(guān)系數(shù)r以及有效抑制中濃度（EC50）。

2結(jié)果與分析

2.1供試多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的抑制作用

從表2可以看出，來自河南的萊氏野村菌Nr41對3%多抗霉素耐藥性最強(qiáng)，在濃度為3 mg/mL時(shí)，抑菌率為673%；在濃度≤1.2 mg/mL時(shí)，抑制率低于50%。在濃度為 3 mg/mL 時(shí)，來自山東和安徽的萊氏野村菌Nr13和Nr19抑制率較高，分別為87.3%、88.5%，其中來自安徽的Nr19幾乎沒有生長。隨處理濃度的降低，其對3株萊氏野村菌的抑制作用減弱。

2.2供試多抗霉素對不同地域萊氏野村菌的毒力測試結(jié)果

表2多抗霉素對3株萊氏野村菌的抑制作用

處理濃度

（mg/mL）Nr13Nr19Nr41處理直

徑（mm）抑菌率

（%）處理直

徑（mm）抑菌率

（%）處理直

徑（mm）抑菌率

（%）3.01.1587.3a0.8088.5a5.267.3a2.01.8579.6a1.2082.7b5.863.5a1.52.1576.2a1.5078.4b7.254.7a1.23.2064.6b2.7061.2b8.149.1a0.63.8557.5c3.2553.2c9.242.1a空白9.056.9515.9注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平差異顯著。

試驗(yàn)中采用生長速率法測定3%多抗霉素對不同地域的3株萊氏野村菌Nr13（山東）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）的抑菌活性，結(jié)果見表3，其中殺菌劑對病菌的EC50代表殺菌劑對病菌抑菌活性的高低[12]。由表3可知，來自河南的萊氏野村菌Nr41對3%多抗霉素的耐藥性最強(qiáng)，其EC50值為 1054 0 mg/mL；其次是來自安徽的Nr19，其EC50值為 0.554 4 mg/mL；耐藥性最弱的是來自山東的Nr13，其EC50值為0.437 7 mg/mL。表3多抗霉素對3株萊氏野村菌的耐藥性

菌株菌株來源地毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)rEC50

（mg/mL）EC90

（mg/mL）Nr13山東平陰孝直y=0.443 9x+0.658 30.972 20.437 73.503 4Nr19安徽繁昌y=0.544 9x+0.639 60.951 90.554 43.005 3Nr41河南南陽y=0.384 0x+0.491 10.974 41.054 011.610 3

3結(jié)論與討論

近年來，生防制劑作為有害生物綜合治理（integrated pest management，簡稱IPM）的重要組成部分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要的作用。丁子香酚、多抗霉素B、枯草芽孢桿菌和木霉菌均屬于生物殺菌劑，對人畜安全，對自然環(huán)境安全、無污染，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等[13-15]。本研究結(jié)果表明，3%多抗霉素對不同地域的萊氏野村菌Nr13（山東）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）都具有抑制活性。但3%多抗霉素對這3株萊氏野村菌的抑制效果均表現(xiàn)出一定的差異性，其中對來自河南的Nr41耐藥性最佳，其EC50值為1.054 0 mg/mL，這對篩選具有耐藥性的萊氏野村菌菌株具有一定的參考意義。本研究中多抗霉素對萊氏野村菌的EC50值為0.437 7～1.054 0 mg/mL。劉保友采用菌絲生長速率法測定蘋果斑點(diǎn)落葉病菌對多抗霉素的敏感性，結(jié)果表明，多抗霉素對多數(shù)蘋果斑點(diǎn)落葉病病菌的菌絲生長具有良好的抑制效果，EC50值為4.165 5～103.462 1 mg/mL[16]。奉代力等采用生長速率法測定10%多抗霉素B 可濕性粉劑對番茄灰霉病菌的EC50值為6.32 mg/L[7]。張亞等采用菌絲生長抑制法對煙草赤星病進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，3%多抗霉素對煙草赤星病的EC50值為0.383 5 mg/mL[17]。可見，多抗霉素對蘋果斑點(diǎn)落葉病、番茄灰霉病和煙草赤星病的EC50值都小于其對萊氏野村菌的EC50值，因此，農(nóng)用抗生素多抗霉素和萊氏野村菌孢子復(fù)配使用時(shí)，在一定濃度下，多抗霉素可以殺死其他真菌，而萊氏野村菌不受影響，這樣殺蟲毒力強(qiáng)[4]的萊氏野村菌可以寄生在害蟲體內(nèi)，至其死亡，實(shí)現(xiàn)同時(shí)殺菌殺蟲的目的，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，緩解化學(xué)防治對環(huán)境的壓力；同時(shí)為控制江蘇省煙草、番茄等農(nóng)作物的主要害蟲和真菌病害，促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供必要的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅寬，王莊. 利用拮抗的Pseudomonas spp.和無致病力的P. solanacearum防治青枯病的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，1983，13（1）：51-56.

[2]Wilcox W F，Harman G E.Control of Phytophthora root rots of soybeans and raspberries with Trichoderma and Gliocladium spp.[J]. Petria，1991，1：140-144.

[3]宋寶安. 新雜環(huán)農(nóng)藥：殺菌劑卷[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：432.

[4]裘維蕃，余永年，卯曉嵐，等. 菌物學(xué)大全[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998：960-961.

[5]齊永霞. 白僵菌和綠僵菌在植物根際的定殖及對幾種土傳植物病原真菌的抑制作用研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：49.

[6]譚可欣. 新多氧霉素的生產(chǎn)與應(yīng)用研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：32-34.

[7]奉代力，王強(qiáng)，鄭紀(jì)慈，等. 幾種殺菌劑對番茄灰霉病菌的抑菌效果對比研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：119-123.

[8]蔣婧婧. 萊氏野村菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：34-35.

[9]姜興印. 抗藥木霉菌高效生防菌株生物學(xué)及其制劑加工技術(shù)[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：17-68.

[10]孫廣宇，宗兆鋒. 植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[11]NY/T1156.2—2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第2部分： 抑制病原真菌菌絲生長試驗(yàn)平皿法[S].

[12]奉代力，王強(qiáng)，陳麗萍，等. 2種常見番茄致病真菌對幾種殺菌劑的敏感性測定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（16）：96-99.

[13]魏艷敏. 生物農(nóng)藥及其應(yīng)用技術(shù)問答[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

[14]高立起，孫閣. 生物農(nóng)藥集錦[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[15]胡永紅，曹崢，楊文革，等. 多效霉素研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：1-4.

[16]劉保友，王英姿，張偉，等. 蘋果斑點(diǎn)落葉病病菌對多抗霉素的抗藥性及其地理分布[J]. 中國果樹，2013（4）：49-51.

[17]張亞，何可佳，劉薇，等. 幾種藥劑防治煙草赤星病的藥效試驗(yàn)[J]. 煙草科技，2009（10）：61-64.劉麗華，王雙，關(guān)磊. 北烏頭乙醇提取液對菜青蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：146-147.