顧炳朝　岳緒國　楊軍　等

摘要：利用單核苷酸多態(tài)性標記（SNP）構建鎮(zhèn)油6號等15個油菜品種（系）的指紋圖譜，分析它們之間的遺傳相似性，并通過聚類分析明確它們之間的關系；利用SSR標記分析5個品種的遺傳相似系數(shù)，SNP標記與SSR標記的遺傳相似系數(shù)間的相關系數(shù)為0.82，達顯著水平，表明2種方法所得的指紋圖譜間具有較高的一致性，但SNP標記指紋圖譜所含差異位點信息較多，比SSR標記圖譜更好。

關鍵詞：油菜；品種；指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號： S634.301文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0087-03

收稿日期：2014-02-28

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（11）1026]；江蘇省科技支撐（農(nóng)業(yè)）計劃（編號：BE2013435）。

作者簡介：顧炳朝（1956—），男，江蘇常州人，副研究員，主要從事油菜育種與品種推廣工作。Tel：（0511）87265433；E-mail：gbc0115@163.com。鑒別優(yōu)良品種的DNA指紋特性，對品種保護具有重要意義。SSR等分子標記技術可鑒定個體或種群基因組之間的特異性DNA片段，通過大量的標記分析可對品種的指紋圖譜作出鑒別[1-4]。為鑒別油菜的指紋圖譜，學者通過十多年研究，制定了油菜指紋圖譜的國家標準（GB/T 19557.1—2004），該標準從眾多的標記中精選出40對引物用以鑒定油菜品種指紋圖譜，具有工作量小、快速有效的特點。油菜品種的鑒定包括形態(tài)鑒定、標記鑒定、數(shù)量性狀鑒定等多個方面。在SSR指紋圖譜鑒定基礎上，可能會發(fā)現(xiàn)某些品種的SSR標記圖譜間沒有或者僅有很小的差異，這并不意味著2個材料就是完全相同的，還需要進一步作種植鑒定[5-9]，若種植鑒定有差別可認為是2個品種。出現(xiàn)這種情況的原因可能是標記區(qū)段不能夠覆蓋油菜品種差異區(qū)段，或者指紋圖譜不夠精細導致品種基因組差異沒被檢測到。單核苷酸多態(tài)性標記（SNP）技術的出現(xiàn)，為指紋圖譜鑒定提供了新方法[10-12]。采用芯片技術的SNP標記分析方法可以提供數(shù)量眾多的標記信息，在基因定位和基因功能研究等方面應用廣泛，也是指紋圖譜鑒定的較好方法。油菜SNP芯片含有5.2萬個標記位點，可否用于鑒別油菜的指紋圖譜值得探討。本研究首次采用了SNP標記技術，以油菜新品種鎮(zhèn)油6號等為材料[13-14]，研究這些品種的指紋圖譜，并且為油菜指紋圖譜鑒定提供新方法。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用油菜品種8個，分別為鎮(zhèn)油6號、Tapidor、中雙11號、寧油16、史力佳、史力豐、秦優(yōu)7號和油研817；以及鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所育成品系8個，分別為ZJ196、ZJ197、ZJ254、ZJ263、ZJ267、ZJ426、ZJ427和ZJ429。

1.2DNA的提取

供試材料在長至6～8張真葉時取樣，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。SSR標記試驗采用SDS法提取DNA，SNP標記試驗采用CTAB法提取DNA。

1.3SSR標記試驗方法

采用GB/T 19557.1-2004《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》中使用的40對SSR引物。SSR反應體系采用10 μL體系：1 μL DNA（50 ng/μL），1 μL 10× PCR Buffer，0.2 μL dNTPs（2mM），0.1 μL TaqE（5 U/μL），0.5 μL F-Primer（50 ng/μL），0.5 μL R-Primer（50 ng/μL），6.7 μL ddH2O。PCR擴增程序：94 ℃預變性 5 min；4 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后在72 ℃終延伸10 min，4 ℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳電壓為210 V，時間75 min。固定，滲透，漂洗，顯色，最后拍照和記錄位點。

1.4SNP標記試驗方法

SNP標記試驗采用Infinium芯片技術。供試材料的DNA樣本交北京怡美通德公司完成DNA雜交和芯片檢測，獲得各個品種5.2萬個SNP位點信息，作為指紋圖譜信息。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

各材料的SSR 擴增產(chǎn)物采用二元性編碼，即以1代表有譜帶，以0代表無譜帶，將所得到的0和1數(shù)據(jù)按順序排列構成品種的指紋圖譜，計算遺傳相似系數(shù)。用非加權組平均法（ UPGMA ），采用Nei氏距離作聚類分析，采用NTSYSpc 2.1軟件繪制聚類圖。

各品種的52 157個SNP位點信息，同樣可作為指紋圖譜信息，并且用于計算遺傳相似系數(shù)。相似系數(shù)使用MATLAB軟件計算，然后用NTSYSpc 2.1軟件作聚類分析。

2結果與分析

2.1SNP標記指紋圖譜

采用SNP芯片技術，檢測了15個品種（系）的SNP標記多態(tài)性，并且利用多態(tài)性信息，計算了品種的相似系數(shù)和Nei氏距離（表1）。結果顯示，ZJ197與ZJ427之間的相似性系數(shù)最小，為0.55；ZJ427與ZJ426及ZJ197與秦優(yōu)7號的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.74；鎮(zhèn)油6號與寧油16的遺傳相似性系數(shù)為0.62；鎮(zhèn)油6號與史力佳的系數(shù)為0.70，也比較大。鎮(zhèn)油6號、寧油16號、史力佳都屬于江蘇本省品種，遺傳系數(shù)居于中等水平。鎮(zhèn)油6號與中雙11號之間的相似性系數(shù)在0.59，與歐洲品種Tapidor的相似系數(shù)為0.61，是比較低的，說明遺傳上相距較遠。鎮(zhèn)油6號與本單位育成的8個品系（以ZJ命名）材料間的相似系數(shù)在0.58～0.62之間，說明選用材料的遺傳差異較大，這與試驗選材指導思想一致。通過遺傳相似系數(shù)可對不同材料作聚類分析（圖1）。從較遠距離的情況看，可歸為2類，一類是ZJ426、ZJ427、ZJ429，其余12份材料可歸為另外一類。聚類圖可明確15個材料的遺傳相似性情況，這為親本選配和材料的遺傳特性評估提供了依據(jù)。表115個油菜品種（系）的SNP標記遺傳相似系數(shù)

品種（系）

2.2SNP標記與SSR標記指紋圖譜的相關性

按照國家標準的方法，采用40對SSR核心引物對5個遺傳材料的DNA進行PCR擴增，得到DNA特征帶型（圖2）。統(tǒng)計分析5個品種之間的指紋信息差別，得到遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.76，其中鎮(zhèn)油6號和Tapidor的相似系數(shù)最小，為0.54，說明它們遺傳關系遠；而史力豐與史力佳之間的相似性系數(shù)最大，為0.76，說明兩者遺傳來源相近（表2）。這些結果與材料的遺傳來源吻合較好。例如，史力豐和史力佳在遺傳上屬于系統(tǒng)系譜的后代，聚類上歸為一類而且相似系數(shù)最大（圖3）。可以看出，油菜SSR指紋圖譜國家標準應用效果還是比較好的。

為研究SNP和SSR標記指紋圖譜的一致性，采用相關性分析方法，計算SSR指紋圖譜的遺傳相似系數(shù)與SNP標記指紋圖譜的相似系數(shù)間的相關性。結果表明，二者之間的相關系數(shù)為0.823 7，達顯著水平，說明二者之間一致性較高，同時

表25個油菜品種的SSR標記遺傳相似系數(shù)

品種遺傳相似系數(shù)中雙11號Tapidor史力豐史力佳Tapidor0.68史力豐0.580.60史力佳0.620.600.76鎮(zhèn)油6號0.590.540.660.71

也說明2種方法所得的指紋圖譜還是有一定差別的。

3討論

物種的標記包括形態(tài)標記、生化標記、SSR標記、SNP標記等多種類型。從標記的豐富程度看，SNP標記的豐富程度最大，SSR標記的豐富程度較好，生化標記和形態(tài)標記的豐富程度最小。理論上，標記的豐富程度越高，則分辨品種間差別的能力越強。采用SSR標記開展作物指紋圖譜鑒定從方法學上看是比較好的。SSR標記的多態(tài)性位點相對較多，目前油菜指紋圖譜鑒定的國家標準中采用的40對引物基本可以鑒別大多數(shù)品種的指紋差異。若品種采用回交等方式育成，可能導致品種間僅有個別區(qū)段差別，此時SSR標記因為數(shù)量有限，不能夠覆蓋基因組，則有可能難以分辨品種間的指紋差別，因此在指紋鑒定結果出現(xiàn)質(zhì)疑情況下，還需要進行形態(tài)鑒定，以便給出品種鑒定的更加可靠的結論。油菜SNP標記數(shù)量多達5萬多個，近似平均覆蓋在全基因組上，可以更好地鑒別品種間的細微差別，可能是品種指紋圖譜鑒定的更好方法。但是用SNP標記鑒定指紋圖譜也有相應不足：（1）SNP標記鑒定的成本較高，若只鑒定單個品種的指紋圖譜，則成本高達2萬元以上，若批量鑒定則成本會有所降低；（2）SNP標記技術依賴芯片技術，在芯片設計時需要根據(jù)若干親本差異核苷酸位點設計探針，檢測得到位點信息，那么親本的選擇對指紋圖譜鑒定結果是有一定影響的；（3）SNP標記能夠鑒別2個等位位點的差別，不能鑒別復等位性位點。

作物品種培育過程中，當形態(tài)性狀達到一致時，即可認為遺傳材料是穩(wěn)定的。然而，此時個體間仍然會有一些不易察覺的數(shù)量性狀差別，往往這種差別被認為是由環(huán)境作用影響的結果，不被重視，這會導致遺傳材料因為環(huán)境改變而出現(xiàn)較大的遺傳分離現(xiàn)象。SNP標記理論上可以鑒定純合和雜合位點，那么就應該可以鑒別品種的純合性。然而，對各個品種（系）的雜合位點統(tǒng)計結果表明，各個品種（系）的雜合位點范圍是8.43%～40.76%。試驗品種中無疑包括純合品種，中雙11號屬于純合親本，其雜合位點率最低。純合親本出現(xiàn)雜合位點可能是芯片技術出現(xiàn)數(shù)據(jù)判讀聚類分析智能性不夠高所造成的。不過，雜合位點百分率作為個體雜合性的參考指標應該是有意義的。研究中發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)油6號的雜合位點率比較低，為9.8%，說明該品種的純合性比較好，而一些育種中間世代品系和雜交種的雜合位點百分率比較高。因此，從育種的角度看，利用遺傳材料的SNP標記圖譜可以幫助說明遺傳純合性問題，使純合性判別更加有效。

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