Progress research on regulation of microRNA on bone remodeling and inflammatory bone resorption

［文獻標(biāo)志碼］A

［文章編號］1671－587Ⅹ（2015）01－0195－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150138

［收稿日期］2014－05－29

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助課題（81271111）

［作者簡介］孫宏晨（1964－），男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，醫(yī)學(xué)博士，高分子化學(xué)與物理學(xué)博士后，主要從事頜骨重塑機制以及納米材料與轉(zhuǎn)基因治療方面的研究。

［通信作者］孫宏晨，教授，博士研究生導(dǎo)師（Tel：0431－88796010，E－mail：hcsun＠m(xù)ail.jlu.edu.cn）

人體骨骼系統(tǒng)終生都能通過骨形成和骨吸收過程不斷進行重塑，并受多種因素影響。慢性炎癥如牙周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等均可以通過干擾骨代謝導(dǎo)致骨質(zhì)的吸收破壞 ［1］。目前普遍采用促進成骨細胞性骨形成、抑制破骨細胞性骨吸收的治療策略維持機體的骨重塑平衡。miRNA是一類起源于內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物、由18～22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，通過抑制靶mRNA的翻譯或增強靶mRNA的降解來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平基因表達 ［2］，在細胞增殖、分化、凋亡和代謝等生物學(xué)功能上具有重要的作用，并進一步參與細胞分化、組織發(fā)育、器官形成以及疾病發(fā)生 ［3－4］。研究 ［1］表明：miRNA不僅參與了炎癥反應(yīng)，而且通過多個信號通路對成骨細胞和破骨細胞等的增殖、定向分化和功能維持發(fā)揮調(diào)控作用。miRNA還通過調(diào)控炎性因子的表達進一步參與成骨細胞和破骨細胞介導(dǎo)的炎癥性骨吸收。因此，以miRNA為靶點、不僅對闡明骨破壞性疾病的發(fā)生機制具有重要的理論意義，而且對治療骨相關(guān)性疾病亦具有重要的臨床意義。

1　miRNA的形成及作用機制

除Y染色體，人類其他染色體上均能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄為miRNA的基因序列。miRNA的啟動子受表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。機體內(nèi)miRNA的合成需要經(jīng)過多個步驟，包括轉(zhuǎn)錄、初級miRNA轉(zhuǎn)錄本（primary miRNA，pri－miRNA）的加工、運輸至胞漿、miRNA前體（precursor miRNA，pre－miRNA）的加工、復(fù)制鏈的選擇和靶定轉(zhuǎn)錄等，這種嚴(yán)格的多步合成過程有助于確保只有具備正確序列和結(jié)構(gòu)的miRNA才能調(diào)控基因的表達 ［5］。

miRNA的基因來自于編碼蛋白或非編碼蛋白的內(nèi)含子或獨立編碼miRNA的基因序列。在細胞核內(nèi)，miRNA基因序列首先經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri－miRNA ［6］。在哺乳動物中，primiRNA在RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Drosha與DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)基因8（Drosha－DiGeorge syndrome critical region gene　8，DGCR8）復(fù)合物作用下，加工成為60～100nt的發(fā)夾狀pre－miRNA，繼而在轉(zhuǎn)運蛋白Exportin　5的協(xié)助下從核內(nèi)運輸至胞質(zhì)中 ［7］。在細胞質(zhì)中，另一種RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Dicer與其搭檔蛋白TRBP（Dicer－TAR RNA binding protein）所形成的復(fù)合物對pre－miRNA進行切割，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似于小干擾RNA的二聚體（雙鏈miRNA） ［8］。RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA－induced silencing complex，RISC）由Dicer酶、TRBP、PKR的蛋白活化劑（protein activator of PKR，PACT）和Ago蛋白組成，雙鏈miRNA 與RISC結(jié)合后被解旋酶分成兩條鏈，其中一條是成熟的miRNA引導(dǎo)鏈，而另一條互補的隨從鏈miRNA＊則立即降解 ［8］。見圖1（插頁四，圖中紅色標(biāo)記部分為成熟的miRNA鏈）。

miRNA與RISC復(fù)合物發(fā)揮抑制靶mRNA作用的方式取決于miRNA和靶mRNA之間的配對程度。成熟miRNA 的5′端具有與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）特異互補的“種子序列（seed region）”，這種靶向結(jié)合能引導(dǎo)靶mRNA的降解或抑制其翻譯 ［9］。若miRNA與靶mRNA的堿基完全配對，則核酸內(nèi)切酶Ago2降解靶mRNA，此過程可能發(fā)生在RNA加工小體中（processing bodies，P－body）；然而，若含有膨隆部分的miRNA和靶mRNA以不完全配對的形式結(jié)合則會引起翻譯抑制，此為脫腺苷化作用的結(jié)果 ［10］。多數(shù)mRNAs的翻譯起始是由于其5′帽端的m7G被真核翻譯起始因子eIF4E識別所引起的。目前有研究 ［11］表明：RISC中的Ago蛋白成分其中心區(qū)域有著與eIF4E帽結(jié)合區(qū)同源的序列，能夠與eIF4E競爭發(fā)揮翻譯抑制的作用。

2　骨重塑和炎癥性骨吸收

成骨細胞和破骨細胞是參與骨吸收和骨形成過程的重要細胞。有研究 ［12］顯示：多能間充質(zhì)干細胞通過Runx　2、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）和β－鏈蛋白（β－catenin）等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控向成骨細胞分化。單核細胞／巨噬細胞系統(tǒng)通過巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）、RANKL、腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素（IL）等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控向破骨細胞分化。當(dāng)活化的成骨細胞在吸收陷窩中分泌新的骨基質(zhì)時，能夠通過骨保護素（osteoprotegerin，OPG）／核激活因子受體（receptor activation of NF－κB，RANK）／核激活因子受體配體（Ligand of receptor activation of NF－κB，RANKL）軸的作用，參與破骨細胞分化的負(fù)性調(diào)控過程，從而引起骨重塑的發(fā)生 ［13］。一旦破骨細胞達到高度活躍的程度或成骨細胞分泌的骨基質(zhì)不足以填補吸收陷窩時就會干擾骨重塑的平衡，引起骨量減少或骨質(zhì)疏松癥 ［1］。

但是，骨重塑的平衡常被炎癥因子打破，在炎癥條件下，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的炎癥因子如TNF、IL－1和IL－6等不僅能使炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，還能顯著增強破骨細胞的生成和功能，從而激活骨吸收途徑，抑制骨重建。盡管破骨細胞的激活和分化主要依賴成骨細胞產(chǎn)生的M－CSF和RANKL，但TNF、IL－1和IL－6的存在能顯著增強破骨細胞的生成和功能 ［14］。因此炎癥反應(yīng)間接參與了局部或系統(tǒng)性骨質(zhì)流失的發(fā)生。

3　miRNA對骨重塑的直接調(diào)控作用

3.1　調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）向成骨細胞分化的miRNA BMMSCs是一類具有自我更新能力的多能干細胞，不僅可沿包括成骨細胞在內(nèi)的多個譜系方向分化，還能夠?qū)Χ喾N環(huán)境因素作出應(yīng)答 ［15］。胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase2，ERK）通路在骨形成調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，包括對Runx2／Cbfa－1的磷酸化作用及誘導(dǎo)OSX基因表達等。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號通路與胞外基質(zhì)蛋白激活的ERK1／2信號通路間具有密切聯(lián)系。有研究 ［16］結(jié)果顯示：破壞FAK信號通路會抑制OSX轉(zhuǎn)錄活性和hMSC成骨分化。證實了FAK是成骨細胞分化的力傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因素。①miRA－138。Eskildsen等 ［17］篩查了成骨細胞分化期間人類BMMSCs中表達有差異的miRNAs，并認(rèn)定miR－138是成骨性分化過程的潛在抑制劑。通過PicTar軟件預(yù)測并證實了miR－138潛在靶作用位點為編碼FAK蛋白的蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase　2，PTK2）。FAK 和PTK2能夠激活ERK1／2信號通路，從而使Runx2磷酸化及OSX上調(diào)使BMMSCs向成骨方向分化。利用antimiR －138抑制miR－138對FAK信號通路的活化過程，結(jié)果體內(nèi)異位成骨增多且體外成骨分化明顯增強；反之，miR－138過表達能抑制骨形成。表明miR－138能通過抑制FAK及其下游信號來抑制骨的形成過程。②miRNA－31。目前對于miRNA－31在BMMSCs向成骨細胞系分化過程中發(fā)揮的功能尚存爭議。Gao等 ［18］采用微陣列芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR－31在體外成骨分化過程中表達下調(diào)，并通過生物信息學(xué)分析證明Runx2是其作用靶點。在隨后的相似研究中，Baglìo等 ［19］通過基因芯片技術(shù)分析了BMMSCs成骨分化時的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR－31表達上調(diào)并證實其靶定目標(biāo)之一是骨特異性轉(zhuǎn)錄因子OSX。另一個體外研究組還提出了在miR－31、Runx2和Satb2（special AT－rich sequence－binding protein　2）間還存在反饋調(diào)節(jié)通路：在BMMSCs分化過程中Runx2介導(dǎo)了miR－31的表達下調(diào)，從而增加了Satb2蛋白水平并促進BMMSCs其向成骨細胞系的分化 ［20］。

3.2　調(diào)控成骨細胞功能的miRNA Dicer酶是miRNA成熟所必須的酶。為了探究miRNA對骨重塑的調(diào)控作用，普遍利用基因敲除技術(shù)使小鼠體內(nèi)的Dicer酶功能缺失，再依據(jù)其表現(xiàn)型間接分析miRNA與成骨或破骨間的關(guān)系。Gaur等 ［21］采用Cre－loxP系統(tǒng)的條件性敲除技術(shù)，通過成骨細胞特異性標(biāo)志物鼠Ⅰ型膠原（COL1A1）基因和骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）基因的啟動子來驅(qū)動Cre重組酶的表達，使其特異性識別LoxP重組序列從而去除靶基因片段。利用COL1A1啟動子敲除骨祖細胞中的Dicer基因，會引起小鼠胚胎晚期死亡。而靶定敲除成熟成骨細胞中表達OC啟動子的Dicer基因，可導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出圍產(chǎn)期的骨鈣化延遲現(xiàn)象。因此，可以說明經(jīng)Dicer加工的miRNA的產(chǎn)物對于孕期骨骼發(fā)育以及產(chǎn)后骨的生長非常關(guān)鍵。①miR－2861。miR－2861是一種在小鼠原代成骨細胞中高表達的miRNA基因。當(dāng)小鼠骨髓基質(zhì)細胞中的miR－2861基因被沉默，就會導(dǎo)致BMP－2誘導(dǎo)的成骨細胞分化能力下降，而miR －2861的過表達則會促進成骨細胞分化。BMP信號能刺激Runx2乙酰化并抑制Smurf介導(dǎo)的Runx2降解，而組蛋白去乙酰化酶5（histone deacetylase　5，HDAC5）則干擾該過程使成骨分化受抑制。熒光素酶報告證實HDAC5是miR －2861的靶基因，所以抑制HDAC5的miR－2861可使乙?；腞unx2大量增加繼而促進成骨細胞分化。此外，有臨床研究 ［22］表明：人類體內(nèi)的Pre－miR－2816突變會導(dǎo)致原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。近期又有研究 ［23］證實：與miR－2861處于同一基因座位點的miR－3960也具有類似的調(diào)控作用，并建立了一個Runx2／miR－3960／miR－2861正反饋調(diào)控系統(tǒng)，促進成骨細胞的分化。這些研究都說明miRNA在骨代謝紊亂性疾病中發(fā)揮的作用。②miRNA－15b。最新研究 ［24］發(fā)現(xiàn)：miR－15b對成骨細胞分化具有正向調(diào)控作用。在BMP蛋白與其受體結(jié)合后，SMAD蛋白家族磷酸化從而激活Runx2和其他成骨標(biāo)志性基因。Smurf1作為SMAD特異的泛素蛋白連接酶，可與轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互作用并通過蛋白酶途徑使其降解。用miR－15b抑制劑處理成骨分化時期的hBMSCs，結(jié)果Runx2的蛋白水平下降；反之，miR－15b的過表達會顯著增加Runx2水平，降低Smurf蛋白水平。經(jīng)熒光素酶報告證實，miR－15b可直接靶定Smurf的3′UTR使Smurf蛋白降解。因此，miR－15b能抑制Smurf1的降解作用從而間接保護Runx2蛋白來促進成骨細胞分化。

3.3　調(diào)控破骨細胞功能的miRNA　目前關(guān)于miRNA在破骨細胞中作用的研究相對有限，但也可通過特異敲除破骨細胞不同時期的Dicer基因來確定miRNA的功能。敲除骨祖細胞中的Dicer會使小鼠因破骨細胞數(shù)目及骨吸收減少而表現(xiàn)出輕微的骨硬化現(xiàn)象，但對成骨細胞卻無影響 ［25］。敲除成熟破骨細胞的Dicer，結(jié)果破骨細胞數(shù)量減少導(dǎo)致骨小梁處的骨沉積增多。由于破骨細胞的分化是經(jīng)RANKL和巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）介導(dǎo)的，所以在敲除Dicer基因時，M－CSF受體表達的下降與破骨細胞數(shù)量減少有密切聯(lián)系 ［26］?？梢姡蕾嘍icer酶成熟的miRNAs對于骨吸收的調(diào)控是必不可少的。①miR－124。在RANKL激活破骨細胞分化的過程中，活化T細胞核因子蛋白1 （NFATc1）作為主要的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要作用。研究 ［27］表明：miR－124通過抑制NFATc1的表達調(diào)控了小鼠骨髓巨噬細胞分化為破骨細胞的過程。通過特異性抑制miR－124結(jié)果增強了破骨細胞的分化和NFATc1的表達。同時，miR－124也影響了破骨細胞前體細胞的增殖及運動。這些研究結(jié)果不僅揭示了miR－124在破骨細胞形成中的重要作用，還闡述了NFATc1在破骨細胞形成中新的調(diào)控方式。②miR－223。Sugatani等 ［28］發(fā)現(xiàn)：在RAW264.7中，pre －miR－223前體的高表達能完全阻止抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色陽性的多核細胞形成，而敲除miR－223基因會使經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞樣細胞減少。在隨后的研究 ［25］中又發(fā)現(xiàn)：通過影響NFI－A和MCSF受體的表達，可實現(xiàn)miR－223對破骨細胞形成的調(diào)控。這些研究結(jié)果表明：適當(dāng)?shù)膍iR－223表達水平對破骨細胞的正常分化和形成具有重要作用。

4　炎癥條件下miRNA對骨重塑的間接調(diào)控作用

Toll樣受體（Toll－like receptors，TLR）是一類表達于固有免疫細胞上的識別分子，能通過與病原體相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）的特異結(jié)合活化細胞內(nèi)信號通路激酶，促進炎癥因子的表達并產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。目前有研究 ［29］證明：miRNA可識別TLR并對TLR信號通路中的細胞因子具有負(fù)性調(diào)控作用。

4.1　miRNA－155　Ceppi等 ［30］發(fā)現(xiàn)：包括miR－155在內(nèi)的多種miRNAs參與了細菌脂多糖（LPS）對樹突細胞（dendritic cells，DCs）刺激后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。利用鎖核酸沉默技術(shù)（LNA silencing，lock nucleic acid silencing）與基因芯片相結(jié)合的方法，證實了TLR／IL－1炎癥信號通路是miRNA－155的作用靶點，且miR－155能直接調(diào)控TAK1結(jié)合蛋白2（TAK1 binging protein　2，TAB2）的水平。TAB2作為TLR通路級聯(lián)反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子能夠促進依賴IL－1的TRAF6泛素化并激活p38和NFκB。在DCs成熟早期，miR－155低表達能活化p38MAPK通路從而促進IL－1β的表達，而miR－155又直接受控于IL－1β及其信號通路級聯(lián)反應(yīng)；在DCs成熟晚期，miR－155高表達會抑制p38 MAPK通路，沉默IL－1和細胞細胞因子的表達 ［30］。因此在成熟DCs中，miR－155通過負(fù)反饋通路下調(diào)由微生物刺激所產(chǎn)生的炎癥因子。

骨形態(tài)蛋白（BMPs）能誘導(dǎo)異位骨形成，并受炎癥因子（如TNF）的負(fù)性調(diào)控作用。TNF－α通過NF－κB通路抑制BMP信號或通過激活應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）／氨基末端激酶（JNK）信號通路抑制由BMP誘導(dǎo)的成骨細胞活性 ［1］。有研究 ［31］表明：在BMP－2所誘導(dǎo)的成骨分化過程中，沉默miR－155基因能減輕由TNF－α介導(dǎo)的成骨抑制作用；經(jīng)生物信息學(xué)分析證實miR－155的靶點是細胞信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling　1，SOCS1）的3′UTR，且TNF－α可通過JNK信號通路誘導(dǎo)miR－155的表達，表明TNF－α通過作用miR－155調(diào)控成骨分化的。

4.2　miR－29　巨噬細胞和NK細胞分泌的干擾素γ （interferonγ，IFN－γ）可抑制IL－1和TNF－α對破骨細胞活性的誘導(dǎo)，從而調(diào)控破骨細胞的分化。用細菌感染小鼠會使NK細胞中miR－29表達下調(diào)，而熒光素酶報告顯示miR－29可直接結(jié)合IFN－γ的3′UTR來抑制mRNA翻譯。因此，miR－29能通過靶定IFN－γ抑制胞內(nèi)病原體所引起的炎癥反應(yīng) ［32］。盡管目前尚無研究直接驗證miR－29在炎癥條件下與骨重塑的必然聯(lián)系，但已有研究 ［33］結(jié)果表明：miR－29的表達能通過正反饋途徑來調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路，從而促進成骨細胞分化。由此可推斷，miR－29或許在一定程度上是通過調(diào)控炎癥因子來影響成骨細胞分化的。

5　展　望

作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNA雖然在所有RNA中的比重很小，卻參與了人類體內(nèi)約三分之一基因表達和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過程。近年來，miRNAs在基因表達調(diào)控領(lǐng)域里的研究已有了突破性進展，很多組織特異性的miRNAs其功能在骨和關(guān)節(jié)組織中已經(jīng)被證實。盡管如此，識別miRNAs其潛在的靶點仍是需要深入研究，還有大量對骨具有重要作用的miRNAs有待發(fā)現(xiàn)，并需進一步明確其在骨形成、骨重塑、骨損傷修復(fù)及炎癥相關(guān)性骨疾病中發(fā)揮的作用。隨著對miRNA調(diào)控機制的不斷深入了解，應(yīng)用miRNA治療炎癥性骨吸收和骨代謝紊亂疾病將會在不遠的將來成為現(xiàn)實。