魏華萍，趙小利，高春記

解放軍總醫(yī)院 血液科，北京 100853

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞系統(tǒng)惡性克隆性疾病，主要特征為血和尿中出現(xiàn)M蛋白以及骨髓中漿細(xì)胞惡性增生。傳統(tǒng)的化療、造血干細(xì)胞移植以及近年使用的蛋白酶體抑制劑雖然都有一定療效，但仍無法完全治愈。免疫治療近年來得到快速發(fā)展，目前取得成功治療的免疫治療類型主要包括：1)單克隆抗體的靶向治療；2)異基因造血干細(xì)胞移植；3)疫苗治療；4)T細(xì)胞抑制通路阻滯劑；5)輸注T淋巴細(xì)胞，包括輸注嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾淋巴細(xì)胞等[1]。CAR細(xì)胞治療在最近的臨床實(shí)驗(yàn)中顯示較好的治療效果，本綜述總結(jié)了嵌合抗原受體修飾淋巴細(xì)胞的設(shè)計(jì)及在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床應(yīng)用。

1 CAR細(xì)胞的設(shè)計(jì)原理

1.1 CAR的構(gòu)建原理 CAR需要體外人工合成，其構(gòu)建主要包含抗原結(jié)合部分、鉸鏈、跨膜段及胞內(nèi)信號(hào)段。通常情況下，胞外段主要為抗原結(jié)合部分，即單鏈抗體scFv(single-chain antibody)，主要由識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的抗體輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH)通過鉸鏈連接而成。這種scFv可以識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞如淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤及多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的靶抗原即腫瘤相關(guān)抗原。這種scFv可以使T細(xì)胞以非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，從而用于CAR的靶點(diǎn)增多，且不局限于蛋白抗原，也可以是糖類抗原等其他抗原[2]?？缒ざ慰梢允荂D4、CD8、CD28、CD3ζ或FcεRIγ的單鏈或者二聚體。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)段一直備受關(guān)注，第一代的CAR主要是CD3ζ或者FcεRIγ，雖然有抗腫瘤效果，但作用短暫，不能持續(xù)在體內(nèi)發(fā)揮作用。因此，第二代CAR在一代基礎(chǔ)上引入1個(gè)共刺激分子(CD28、4-1BB或其他共刺激分子如CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、CD27、CD224、ICOS及DAP10等)。在臨床應(yīng)用中，第二代CAR表現(xiàn)出更好的體內(nèi)擴(kuò)增能力及抗腫瘤能力。第三代CAR是在一代的基礎(chǔ)上加入兩個(gè)或以上的共刺激分子，其目的在于進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的擴(kuò)增、細(xì)胞毒效應(yīng)及體內(nèi)的存活時(shí)間，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤效果增加，但同時(shí)不良反應(yīng)也增大。因此，目前大量的臨床研究都是評(píng)價(jià)二代CAR的設(shè)計(jì)[3]。最新的研究把以上的CAR均稱為傳統(tǒng)CAR；而把胞外段設(shè)計(jì)為非scFv的CAR稱為生理CAR，如把CD27全長(zhǎng)、NKG2D、血管內(nèi)皮生成因子等連接到CD3ζ的CAR；而最新一代的CAR，又稱為萬能CAR，其設(shè)計(jì)為生物素或抗-FITC的scFv作為胞外段連接到共刺激分子和CD3ζ。這樣的CAR可結(jié)合生物素或FITC標(biāo)記的抗原特異性抗體或scFv，進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)[4]。

1.2 CAR的效應(yīng)細(xì)胞 構(gòu)建好的CAR需要轉(zhuǎn)導(dǎo)至患者的淋巴細(xì)胞中才能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。用于臨床治療的效應(yīng)細(xì)胞主要有兩種，T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞。由于強(qiáng)大的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，體內(nèi)外容易培養(yǎng)、擴(kuò)增及改造。目前T細(xì)胞是研究最早、最為透徹的細(xì)胞，也是最常用的效應(yīng)細(xì)胞。CAR T細(xì)胞已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床治療CD19+的急、慢性淋巴細(xì)胞白血病。CAR T細(xì)胞治療的弊端在于誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，在異基因造血干細(xì)胞移植的患者中，可誘發(fā)并加重急性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)[5]。目前的研究方向在于提高CAR T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)減少其治療的相關(guān)不良反應(yīng)。

目前的研究改善了CAR效應(yīng)細(xì)胞選擇。在T細(xì)胞選擇方面，目前主要選擇低分化初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞，從而使T細(xì)胞長(zhǎng)期存活，更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。此外，在T細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，加入IL-7、IL-15及IL-21，從而抑制T細(xì)胞的分化。另外，細(xì)胞因子在T細(xì)胞的遷移及抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用，新的研究正試圖在CAR T細(xì)胞中共表達(dá)CXCR2、CCR2b、IL-2、IL-12等因子[4,6]，從而促使CAR T細(xì)胞遷移到腫瘤部位，以更好的發(fā)生殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。

NK細(xì)胞(CD3-CD56+)占循環(huán)淋巴細(xì)胞的20% ~ 30%，是固有免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，其特點(diǎn)是迅速有效地殺傷病毒感染細(xì)胞及突變細(xì)胞。在抗腫瘤效應(yīng)中，由于非MHC的限制，抗腫瘤效應(yīng)強(qiáng)；在造血干細(xì)胞移植患者中，由于不產(chǎn)生GVHD，目前成為CAR治療的新的效應(yīng)細(xì)胞之一[3]，并正在應(yīng)用于早期臨床實(shí)驗(yàn)。此外，NK T細(xì)胞也被選為效應(yīng)細(xì)胞用于CAR的研究，由于NK T細(xì)胞的CD1d分子的單一性，有效地減少了細(xì)胞毒性。研究者利用NK T細(xì)胞的這一免疫特性將其用于成纖維細(xì)胞瘤的治療，發(fā)現(xiàn)GD2-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)NK T細(xì)胞在抗成纖維細(xì)胞瘤效應(yīng)的同時(shí)不增加GVHD的發(fā)生[7]。

1.3 CAR的體外包裝系統(tǒng) 把體外構(gòu)建的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)至患者淋巴細(xì)胞的過程需要包裝系統(tǒng)完成。病毒載體是CAR成功轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞的有效工具。γ逆轉(zhuǎn)錄病毒是最常用的載體，能夠相對(duì)簡(jiǎn)單、高效并持久地把DNA片段整合到人類淋巴細(xì)胞的宿主基因上，使CAR得以表達(dá)，且安全性高，并可以應(yīng)用于臨床；但其有使CAR基因末端長(zhǎng)的重復(fù)序列表達(dá)沉默的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，慢病毒載體也是比較安全的載體，但是價(jià)格較高。在新一代的CAR研究中，研究者嘗試在CAR中加入免疫調(diào)節(jié)因子如白介素(IL)-12、IL-15、CCR2、IL-2等大分子片段，因而載體的選擇尤其重要。相對(duì)高成本的病毒載體如PiggyBac或Sleeping Beauty，非病毒載體如含CRISP/Cas9的載體和核轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)pmaxCloning載體[8]都可應(yīng)用于這種大分子片段的轉(zhuǎn)染。這些新的載體系統(tǒng)都處于研究中，進(jìn)一步豐富及優(yōu)化了CAR的構(gòu)建及臨床應(yīng)用[3,9]。

1.4 CAR細(xì)胞的體外擴(kuò)增 CAR細(xì)胞體外構(gòu)建好以后必須能在體內(nèi)外擴(kuò)增才能達(dá)到臨床應(yīng)用。多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CAR T細(xì)胞能夠治療多種惡性腫瘤，雖然采用了共刺激分子，但是擴(kuò)增過程中大部分CAR T細(xì)胞必須在體外擴(kuò)增到一定數(shù)量才能回輸給患者，而體外擴(kuò)增中每一代細(xì)胞都有被污染的可能。因此，必須保證擴(kuò)增系統(tǒng)安全、高效。研究者最近設(shè)計(jì)了一種新的CAR，即在靶抗原的另一端連接一種10個(gè)氨基酸的獨(dú)特的標(biāo)簽(E-Tag)，通過加入相應(yīng)抗體使CAR T細(xì)胞在體內(nèi)大量擴(kuò)增，并通過這種獨(dú)特的標(biāo)簽使CAR T細(xì)胞得以純化[10]。這種設(shè)計(jì)為以后CAR T細(xì)胞的免疫治療效果提供了新的方法。

2 CAR細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用

腫瘤特異性抗原高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，表達(dá)CAR的淋巴細(xì)胞只有通過識(shí)別并和腫瘤抗原相結(jié)合才能識(shí)別并發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。在多發(fā)性骨髓瘤患者及細(xì)胞系中常見的腫瘤抗原：1)CD74：一種細(xì)胞膜表面Ⅱ型跨膜糖蛋白，參與B細(xì)胞的成熟過程，在B淋巴細(xì)胞系惡性腫瘤尤其是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，與骨髓瘤蒽環(huán)類藥物耐藥有關(guān)[11]?？笴D74單抗治療及阿霉素結(jié)合抗CD74單抗已用于臨床實(shí)驗(yàn)治療多發(fā)性骨髓瘤[12-13]。因此，有望把該抗原作為靶抗原應(yīng)用于CAR的設(shè)計(jì)中，成為多發(fā)性骨髓瘤新的治療靶點(diǎn)。2)B細(xì)胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)：腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，正常情況下主要表達(dá)在漿細(xì)胞、成熟B細(xì)胞表面，病理情況下是漿細(xì)胞系腫瘤的特異性抗原，不表達(dá)在其他組織器官細(xì)胞表面，在防止骨髓瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，因而是CAR治療的主要候選靶抗原之一[14]。針對(duì)該特點(diǎn)，有研究開展了抗-BCMA-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞用于治療多發(fā)性骨髓瘤的Ⅰ期臨床研究，初步研究顯示，該CAR T細(xì)胞具有殺傷骨髓瘤細(xì)胞的作用[15-16]。3)CD138：又稱類肝素樣硫酸蛋白多糖，最初在人骨髓瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)在正常漿細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞表面，主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的活性，從而影響細(xì)胞的成熟及分化[13,17]。研究證實(shí)，CD138260-268抗原肽具有很強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生骨髓瘤抗原特異性效應(yīng)[18]。研究者最近開展了抗CD138-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤的研究，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)其具有抗骨髓瘤效應(yīng)，但效果有一定的局限性[19]。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，加入了干擾素(interferon，IFN)的抗CD138-IFNα-CAR能夠抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，同時(shí)在細(xì)胞系中降低IFN調(diào)節(jié)因子4的表達(dá)，延長(zhǎng)了骨髓瘤小鼠的生存期[20]。這些研究都為多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療提供很好的應(yīng)用前景。4)CS1：一種細(xì)胞表面糖蛋白，免疫球蛋白超家族成員之一，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系及多發(fā)性骨髓瘤患者的漿細(xì)胞表面高表達(dá)。在MM中，主要參與骨髓瘤細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和浸潤(rùn)[13]。研究者首先研發(fā)了抗CS1單克隆抗體HuLuc63[12]，Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該抗體能發(fā)揮很好的抗骨髓瘤效應(yīng)[21]，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CS1239-247抗原肽具有很強(qiáng)的免疫原性[18]。因此，研究者以CS1為靶抗原設(shè)計(jì)的抗CS1-CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能抑制殺傷骨髓瘤細(xì)胞并延長(zhǎng)小鼠的生存期[5]，在另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這一點(diǎn)[22]。需進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證其效應(yīng)。5)Lewis-Y (LeY)：高表達(dá)于許多上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞表面，如直腸癌、膀胱癌、卵巢癌等?？?LeY-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞最早用于治療上述LeY抗原表達(dá)的惡性腫瘤[23]。后來發(fā)現(xiàn)，LeY抗原也表達(dá)于急性髓細(xì)胞性白血病及多發(fā)性骨髓瘤中，并在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抗-LeY-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞具有抗多發(fā)性骨髓瘤及白血病效應(yīng)[24]。目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，用于急性髓細(xì)胞性白血病患者[25]，有望進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。6)黏蛋白1(mucoprotein 1，MUC1)：主要表達(dá)在上皮細(xì)胞表面，病理情況下也表達(dá)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面[26]。目前CAR T細(xì)胞治療惡性血液病的臨床應(yīng)用并不理想，原因在于CAR T細(xì)胞在患者體內(nèi)擴(kuò)增困難，存活時(shí)間短。因而學(xué)者在抗MUC1-CAR T細(xì)胞中連接了IL-4受體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)即使注射少量的抗MUC1-CAR T細(xì)胞也可以在體內(nèi)明顯擴(kuò)增[27]。

隨著腫瘤的進(jìn)展和復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤抗原表達(dá)減弱或產(chǎn)生變異，導(dǎo)致CAR T細(xì)胞治療效果不佳，因此，有學(xué)者構(gòu)建了同時(shí)能表達(dá)白介素-12(IL-12)的CAR T細(xì)胞。IL-12不僅能募集并活化巨噬細(xì)胞，還能協(xié)同CAR T細(xì)胞殺傷靶抗原表達(dá)減弱的腫瘤細(xì)胞[28]。此外，腫瘤細(xì)胞表面的靶抗原隨著進(jìn)展和復(fù)發(fā)而發(fā)生變化，可產(chǎn)生不同的靶抗原，或者多種靶抗原，因此，研究者嘗試并設(shè)計(jì)出能識(shí)別兩個(gè)靶抗原的CAR，但其毒性明顯增強(qiáng)[3]。最新的研究設(shè)計(jì)了抗生物素或異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的CAR T細(xì)胞，這種新的CAR T細(xì)胞通過表面的生物素或FITC可以和多種生物素或FITC包被的抗體結(jié)合，通過抗體和靶抗原結(jié)合發(fā)揮殺傷效應(yīng)[29]。

3 CAR細(xì)胞毒性及安全性

3.1 插入突變基因 在CAR的體外構(gòu)建中，存在片段體外擴(kuò)增、病毒包裝等過程，在這些過程中很可能出現(xiàn)插入突變基因，因此在這些構(gòu)建過程中需要采用安全可靠的方法。長(zhǎng)期以來，人們都擔(dān)心CAR技術(shù)可以導(dǎo)致插入突變基因，但到目前為止在多發(fā)性骨髓瘤仍未觀察到這種效應(yīng)[30]。

3.2 細(xì)胞因子釋放綜合征及腫瘤溶解綜合征 細(xì)胞因子釋放綜合征及腫瘤溶解綜合征是CAR T細(xì)胞治療的主要并發(fā)癥，主要由于CAR T細(xì)胞活化釋放大量細(xì)胞因子(IL-6、IFN-γ及TNF-α等)入血，以及CAR T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞被破壞死亡，核酸代謝產(chǎn)物(尿酸、磷酸鹽)、細(xì)胞內(nèi)分子(鉀)釋放到外周血產(chǎn)生[5-6]。但是，細(xì)胞因子風(fēng)暴與抗腫瘤效應(yīng)正相關(guān)。細(xì)胞因子釋放可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化聚集，B細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等溶解可釋放高水平的IL-6，腫瘤負(fù)荷越高，細(xì)胞因子釋放越多，患者的反應(yīng)越強(qiáng)烈[9]。為了防止細(xì)胞因子綜合征的發(fā)生，輸注CAR T細(xì)胞應(yīng)從小量開始，逐步增加，隨時(shí)監(jiān)控細(xì)胞因子水平，必要時(shí)使用IL-6拮抗劑。在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，目前并未發(fā)現(xiàn)此類反應(yīng)，由于病例數(shù)少，不能排除以后臨床研究中發(fā)現(xiàn)該不良反應(yīng)。

3.3 “打靶”(on-target)毒性 當(dāng)正常組織細(xì)胞表面也同時(shí)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原時(shí)，即使表達(dá)量很低，也會(huì)受到CAR細(xì)胞的攻擊，從而損傷正常組織細(xì)胞，這種效應(yīng)被稱為“打靶”毒性[31]。因此，在設(shè)計(jì)CAR的時(shí)候，要盡量尋找腫瘤特異性強(qiáng)的靶抗原。研究顯示，在以CD19、CD20為靶抗原的CAR T細(xì)胞治療B-CLL時(shí)可以造成持續(xù)的B細(xì)胞發(fā)育不良產(chǎn)生的免疫損傷[32-33]。在多發(fā)性骨髓瘤中，由于多數(shù)靶抗原既存在于骨髓瘤細(xì)胞表面，也存在于漿細(xì)胞及成熟B細(xì)胞表面，雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)，但在臨床應(yīng)用中也可能存在“打靶”毒性，損傷正常漿細(xì)胞及正常成熟B細(xì)胞。

3.4 “脫靶”(off-target)效應(yīng) 由于CAR細(xì)胞的識(shí)別靶位與機(jī)體正常組織細(xì)胞錯(cuò)誤匹配，導(dǎo)致CAR細(xì)胞錯(cuò)殺正常組織細(xì)胞，稱為“脫靶”效應(yīng)[34]。此外，由于CAR細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間長(zhǎng)，可產(chǎn)生攻擊自身組織細(xì)胞的各種不良反應(yīng)也為“脫靶”效應(yīng)。為了減輕或避免這種不良反應(yīng)，一些學(xué)者采用組裝有自殺基因的CAR。最普遍使用的自殺基因?yàn)閱渭儼捳畈《拘剀占っ?HSP-tk)[35]。有的研究者在改造T細(xì)胞時(shí)加入細(xì)胞凋亡蛋白酶9(Caspase9)，使CAR T細(xì)胞在發(fā)揮腫瘤殺傷效應(yīng)后迅速凋亡，從而避免了CAR T細(xì)胞治療的長(zhǎng)期不良反應(yīng)[36]。有的研究為了避免脫靶效應(yīng)使用CTLA-4或者PD-1為基礎(chǔ)的CAR[37]。除此以外，由于NK細(xì)胞存活時(shí)間短、不良反應(yīng)小，為了避免“脫靶”效應(yīng)，可使用NK細(xì)胞。但是NK原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染困難，很難體內(nèi)擴(kuò)增，因此限制了其應(yīng)用。但NK-92細(xì)胞系具有NK原代細(xì)胞的特點(diǎn)，并可體外擴(kuò)增，因而兩個(gè)研究中都采用了NK-92細(xì)胞系作為效應(yīng)細(xì)胞以避免“脫靶“效應(yīng)[5,19]。在這兩個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)“脫靶”效應(yīng)的產(chǎn)生，但仍不能排除在人體試驗(yàn)中存在該效應(yīng)。

4 結(jié)語

嵌合抗原受體修飾淋巴細(xì)胞作為一種新的免疫治療方法，正在大量開展研究并應(yīng)用于惡性腫瘤治療中，有的CAR細(xì)胞在臨床應(yīng)用中取得了令人鼓舞的成績(jī)。對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療一直是研究的熱點(diǎn)，我們期待這種新的治療將來能夠更有效、安全，廣泛應(yīng)用于患者，以延長(zhǎng)患者的生存期并最終治愈疾病。

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