方健源，胡淑芬，李秋嫻，鄒茂賢，謝碧霞

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科1、血液科2，廣東 廣州 511400)

流式技術檢測外周血白血病細胞在AML復發(fā)監(jiān)測中的應用

方健源1，胡淑芬1，李秋嫻1，鄒茂賢1，謝碧霞2

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科1、血液科2，廣東 廣州 511400)

目的 探討多參數(shù)流式技術(FCM)檢測外周血白血病細胞在急性髓細胞白血病(AML)復發(fā)監(jiān)測中的臨床應用價值。方法選擇2012年1月至2014年6月我院血液科收治的56例AML患者，于首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月應用FCM定期檢測患者外周血標本，同時檢測骨髓細胞形態(tài)學的變化。MRD≥0.01%為MRD陽性，否則為MRD陰性。AML患者首次誘導化療結束后外周血MRD水平分為高(MRD≥10-2)、中(10-2＜MRD＜10-4)、低(MRD≤10-4)三個水平。采用χ2檢驗方法比較首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月的MRD陽性組和MRD陰性組復發(fā)率差異，同時比較首次誘導化療結束后外周血MRD高、中、低三組復發(fā)率差異。結果FCM檢測外周血MRD陽性組在首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月的復發(fā)率分別為72.7%、89.3%、93.8%，MRD陰性組分別為25.0%、18.1%、0；MRD陽性組與MRD陰性組相比較，首次誘導化療結束(χ2=7.240，P=0.007)、鞏固化療6個月(χ2=15.554，P=0.000)、鞏固化療12個月(χ2=19.562，P=0.000)三個時間點的復發(fā)率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；首次誘導化療結束后外周血MRD高水平組的復發(fā)率明顯高于中水平組(χ2=8.207，P=0.004)、低水平組(χ2=14.667，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。中水平組的復發(fā)率與低水平組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.398，P=0.237＞0.05)。結論FCM檢測外周血白血病細胞對診斷AML復發(fā)及指導個體化治療有重要意義。

流式技術；外周血；白血病細胞；復發(fā)

急性髓細胞白血病(AML)是一種由于造血干/祖細胞基因突變所致的惡性克隆性疾病。目前的治療手段主要包括誘導及鞏固治療以及造血干細胞移植。目前認為造成白血病復發(fā)的關鍵因素是白血病經(jīng)治療后體內(nèi)仍殘留少量的腫瘤細胞，即存在微量殘留白血病細胞(MRD)，這些腫瘤細胞的克隆增殖導致白血病復發(fā)。白血病細胞通常表達異常的表面抗原表型，即白血病相關表型(LAIP)[1]，以及異常光散射特性，因此能與正常造血成分相互區(qū)別。聯(lián)合利用多種單克隆抗體，多參數(shù)流式技術可以同時檢測細胞表面不同抗原表達的多參數(shù)熒光信號，進而識別完全緩解后混于正常造血細胞中的MRD。本研究收集AML患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討AML患者外周血白血病細胞的監(jiān)測對AML復發(fā)及指導個體化治療的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年6月我院血液科收治的56例AML患者(不包括急性早幼粒細胞白血病患者)，于首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月定期監(jiān)測。診斷符合法美英協(xié)作組(FAB)及2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標準[2]。

1.2 標本檢測

1.2.1 多參數(shù)流式技術檢測方法 采集外周血(EDTA-K2抗凝)，利用四色熒光(四種熒光素分別為FITC、PE、APC、PerCP)直接免疫標記法進行免疫分型檢測。在每支檢測試管中加1×106有核細胞。根據(jù)每例患者的白血病特點選擇單克隆抗體組合(試劑均為美國BD公司產(chǎn)品)，按照試劑所明書進行操作。至少收集10萬個可供分析的有核細胞，用流式細胞儀(美國BD公司)收集細胞，每支試管用配套的CellQuest軟件分析細胞標志。根據(jù)原始細胞上抗原是否跨系表達、表達不同步(不同階段的抗原同時表達)、表達過強、過弱、丟失等判定是否為MRD，MRD≥0.01%為陽性，否則為陰性。

1.2.2 骨髓細胞形態(tài)學檢測方法 骨髓液涂片6～8張，經(jīng)吉姆薩-瑞士染色后，在日本Olympas顯微鏡油鏡下分類200個細胞，根據(jù)形態(tài)進行不同階段的分類計數(shù)。根據(jù)張之南等[3]主編的第3版《血液病診斷及療效標準》判斷療效是否為復發(fā)。

1.3 治療方案 AML(非M3)的誘導化療方案采用柔紅霉素加阿糖胞苷(DA)、去甲氧柔紅霉素加阿糖胞苷(IA)或米托蒽醌加阿糖胞苷(MA)方案。骨髓達CR后采用原方案鞏固強化治療2個療程后，分別用中或大劑量阿糖胞苷治療，完成4個療程后休息2個月，然后用DA和米MA方案交替2個療程，每個療程間隔3個月，此后停止化療，定期隨訪。

1.4 隨訪 56例AML患者在首次誘導化療結束獲得CR后開始隨訪，定期監(jiān)測，以FAB分型骨髓形態(tài)學作為判斷復發(fā)的金標準，至復發(fā)隨訪結束，未復發(fā)隨訪至今，隨訪時間1～30個月，中位數(shù)16個月。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AML患者首次誘導化療結束后定期監(jiān)測外周血MRD隨訪結果 AML患者首次誘導化療結束獲得CR后開始隨訪，分別在首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月進行外周血MRD檢測。MRD陽性組在首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月的復發(fā)率分別為72.7%、89.3%、93.8%，MRD陰性組分別為25.0%、18.1%、0(表1)。MRD陽性組與MRD陰性組相比較，首次誘導化療結束(χ2=7.240，P=0.007)、鞏固化療6個月(χ2=15.554，P= 0.000)、鞏固化療12個月(χ2=19.562，P=0.000)三個時間點的復發(fā)率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 AML患者首次誘導化療結束后定期監(jiān)測外周血MRD隨訪結果[例(%)]

2.2 AML患者首次誘導化療結束后外周血MRD水平與復發(fā)率的關系 56例AML患者按照首次誘導化療結束后外周血MRD水平分為高(MRD≥10-2)、中(10-2＜MRD＜10-4)、低(MRD≤10-4)三組。經(jīng)統(tǒng)計分析，高水平組的復發(fā)率明顯高于中水平組(χ2= 8.207，P=0.004)、低水平組(χ2=14.667，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。中水平組的復發(fā)率與低水平組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.398，P=0.237＞0.05)。

表2 AML患者首次誘導化療結束后外周血MRD水平與復發(fā)率的關系[例(%)]

3 討 論

FCM是目前檢測白血病微觀水平最有應用前景的方法之一。它是在單細胞水平辨認細胞形態(tài)、大小和熒光特征，從而區(qū)分白細胞和正常細胞的一種方法，其優(yōu)勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞，快速地對各個細胞進行多參數(shù)定量分析，靈敏度達10-4。FCM是基于對白血病細胞特殊表達的免疫表型進行識別來定量檢測MRD，應用多色熒光技術可在1×104或更多正常細胞中檢測出1個白血病細胞。臨床上對急性白血病治療效果的評價主要通過骨髓細胞形態(tài)學檢查，其具有一定的局限性，其診斷標準一般在體內(nèi)白血病細胞數(shù)超過1%時方能檢測到，而體內(nèi)MRD的持續(xù)存在會導致患者最終白血病的復發(fā)。目前MRD檢測大多是以骨髓為標本。由于白血病的非均一分布，加上髓外浸潤以及化療后骨髓重建引起的造血細胞反應性增生，有時會影響MRD的檢測結果。白血病患者反復損傷性骨髓穿刺不易接受，且存在稀釋等問題。從患者角度出發(fā)，外周血取材方便，采集外周血無疑更合適。采用FCM測定MRD是根據(jù)白血病細胞與正常細胞成分之間的抗原表達存在的量或質的區(qū)別來進行的，在某些抗體組合中，它們有時只適合外周血標本的檢測而不適合于骨髓標本的檢測[4]。為此，本文針對AML患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討AML患者外周血白血病細胞的監(jiān)測對AML復發(fā)的臨床指導意義。

Buccisano等[5]認為外周血的檢測同骨髓一樣有意義，如果同時檢測外周血及骨髓，可能提高檢出率。如果鞏固化療后外周血的MRD水平高于0.015%，復發(fā)概率增加。外周血白血病細胞水平可間接反映骨髓情況，用于治療監(jiān)測。目前國際上推薦對白血病的治療采用個體化治療原則。期間動態(tài)監(jiān)測患者白血病細胞的MRD水平直接反映體內(nèi)白血病細胞的負荷量，根據(jù)體內(nèi)白血病細胞的負荷決定治療方案。本研究外周血MRD陽性組在首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月的復發(fā)率分別為72.7%、89.3%、93.8%，MRD陰性組分別為25.0%、18.1%、0。MRD陽性組與MRD陰性組相比較，首次誘導化療結束、鞏固化療6個月、鞏固化療12個月三個時間點的復發(fā)率均有明顯差異。Coustan-Smith等[6]研究在誘導治療結束時和持續(xù)治療第14、32、56周共收集629份標本，每個時間點可檢出MRD陽性(＞10-4)均與高復發(fā)率相關，尤其是誘導治療結束時(＞10-2)或維持治療14周(＞10-3)有高水平MRD的患者預后差。本研究外周血MRD陽性組鞏固化療12個月、鞏固化療6個月的復發(fā)率要比首次誘導化療結束的復發(fā)率要高，考慮與化療強度不夠或對以往的化療藥耐藥有關。

本研究高水平(MRD≥10-2)組的復發(fā)率(95.2%)明顯高于中水平(10-2＜MRD＜10-4)組(52.2%)、低水平(MRD≤10-4)組(25%)。Pawinska等[7]認為，誘導緩解末MRD≥10-4的患者需要在治療過程中嚴密監(jiān)測MRD量的變化，以便及時采取有效治療方案。孫楠楠等[8]研究提出，對ALCR后FCM連續(xù)動態(tài)監(jiān)測MRD發(fā)現(xiàn)，CR后患者MRD水平差異較大，不能作為評價CR的單一指標。而對于每一名處于CR的AL患者而言，隨著治療時間的延長、化療次數(shù)的增多，MRD水平總體上呈現(xiàn)下降趨勢，但是波動幅度較大，且部分MRD陰性患者在鞏固治療過程中出現(xiàn)陽轉。因此，F(xiàn)CM動態(tài)監(jiān)測MRD可為ALCR患者化療方案的選擇提供依據(jù)。根據(jù)MRD水平，對復發(fā)危險度高的患者給予強有力的化療以增加治愈率，對復發(fā)危險度低的患者避免過度化療以減輕副作用，從而實現(xiàn)個體化治療。

MRD是一個強烈提示緩解和復發(fā)的預后因素。臨床應用MRD檢測可有效指導CR后的治療，包括CR、部分緩解(PR)和未緩解(NR)的重新定義，根據(jù)MRD的水平進行預后分級及選擇相應的化療方案等。若MRD持續(xù)陰性，可停止治療；若MRD持續(xù)陽性，應予患者更強的化療，或考慮骨髓移植。在誘導緩解治療期的早期時間點檢測MRD評估預后，價值是否等同于或優(yōu)于在誘導緩解治療末時間點檢測MRD尚待進一步研究證實[9]。很多研究認為其他時間點的檢測結果同樣具有預后意義，且連續(xù)的MRD監(jiān)測可提供更多的預后信息。

綜上所述，F(xiàn)CM檢測外周血白血病細胞也能很好地提示復發(fā)，且外周血取材方便，創(chuàng)傷性相對較輕，對提示AML復發(fā)及指導個體化治療有重要意義。

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Application of flow cytometry for detection of peripheral blood leukemic cells in monitoring of recurrence of acute myeloid leukemia.

FANG Jian-yuan1,HU Shu-fen1,LI Qiu-xian1,ZOU Mao-xian1,XIE Bi-xia2.Department of Clinical Laboratory1,Department of Hematology2,Central Hospital of Panyu District,Guangzhou 511400,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo investigate the application of multi-parameter flow cytometry(FCM)for detection of peripheral blood leukemic cells in monitoring of recurrence of acute myeloid leukemia(AML).MethodsFifty-six patients with AML from January 2012 to June 2014 in Department of Hematology in our hospital were enrolled.Peripheral blood samples of the patients were detected using FCM regularly after the first induction chemotherapy,6 months,12 months of consolidation chemotherapy.Changes in morphology of bone marrow cell were detected. MRD≥0.01%was defined as MRD positive,and MRD＜0.01%was defined as MRD negative.MRD levels of AML patients after the first induction chemotherapy were divided into high level(MRD≥10-2),medium level(10-2＜MRD＜10-4),low level(MRD≤10-4).Chi square test was used to compare the recurrence rates between MRD positive group and MRD negative group after the first induction chemotherapy,6 months,12 months of consolidation chemotherapy. At the same time,the recurrence rates were compared between high level,medium level,low level group after the first induction chemotherapy.ResultsThe recurrence rates after the first induction chemotherapy,6 months,12 months of consolidation chemotherapy were 72.7%,89.3%,93.8%in MRD positive group,25%,18.1%,0%in MRD negative group,with statistically significant difference between the MRD positive group and MRD negative group after induction chemotherapy(χ2=7.240,P=0.007),6 months of consolidation chemotherapy(χ2=15.554,P=0.000)and 12 months of consolidation chemotherapy(χ2=19.562,P=0.000),P＜0.05.After the first induction chemotherapy,the recurrence rate in MRD high level group was significantly higher than that in the medium level group(χ2=8.207,P= 0.004)and low level group(χ2=14.667,P=0.000),and the difference was statistically significant(P＜0.05).There was no statistically significant difference in the the recurrence rate between the medium level group and low level group(χ2=1.398,P=0.237＞0.05).ConclusionFCM detection of Leukemia cells in peripheral blood has important significance for the diagnosis of recurrentAML and guiding individual treatment.

Flow cytometry;Peripheral blood;Leukemic cells;Recurrence

R733.7

A

1003—6350（2015）04—0529—03

2014-08-06)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0191

廣州市番禺區(qū)科技和信息化局科技計劃項目（編號：2012-Z-03-04）

方健源。E-mail：695035605@qq.com