楊 坦， 劉 華， 汪運山△

(1山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南大學-山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院,2山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院中心實驗室, 3山東省移植與組織工程研究中心，山東 濟南 250013)

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·實驗技術·

2種誘導iPSC向神經(jīng)干細胞分化方法的比較*

楊 坦1, 2， 劉 華2, 3， 汪運山2, 3△

(1山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，濟南大學-山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院,2山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院中心實驗室,3山東省移植與組織工程研究中心，山東 濟南 250013)

目的： 整體比較2種促進誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)向神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSC)分化的方法，確定一種穩(wěn)定、高效的獲得NSC的方法，并對NSC進行系統(tǒng)鑒定。方法: 方法A：SB431542和drosomophorin的濃度均為5 μmmol/L，誘導初始密度100%；方法B：SB431542的濃度為5 mmol/L，drosomophorin的濃度為1 mmol/L，誘導初始密度為40%。比較及鑒定方法： 鏡下觀察誘導獲得NSC的狀態(tài)；real-time PCR比較神經(jīng)干細胞相關基因Pax6、nestin、Sox1、Sox2等表達量；流式細胞術分析誘導第16天 Pax6陽性率；免疫熒光定性分析神經(jīng)干細胞相關蛋白的表達及其自發(fā)分化的能力。結果: 方法A獲得的NSC懸起后成球趨勢明顯，圓形，透明；方法B誘導獲得NSC形狀不規(guī)則，色灰暗。Real-time PCR結果證明方法A誘導獲得的細胞神經(jīng)干細胞相關基因的表達量高于方法B。流式細胞術分析證明第16 天，PAX6的陽性率，方法A高于方法B。經(jīng)鑒定，方法A獲得的神經(jīng)干細胞高表達Pax6、nestin、Sox2等基因自發(fā)分化30 d，形成明顯的神經(jīng)纖維束，表達TUJ-1、MAP2及GFAP等神經(jīng)元和膠質細胞的特異性標志物。結論: 方法A整體優(yōu)于方法B，我們推薦方法A作為誘導iPSC向神經(jīng)干細胞分化的方法。

誘導性多能干細胞； 分化； 神經(jīng)干細胞

神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSC)可用于建立神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞模型，因此在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制及治療的研究中日趨重要[1]。神經(jīng)干細胞獲得有以下幾個途徑：(1)從流產(chǎn)的胎兒腦組織中分離[2]，體外擴增，但該來源有限，且受到倫理約束；(2)人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESC)體外分化獲得[3]，此途徑細胞來源受限，存在異體間的免疫排斥反應；(3)尿液細胞轉分化為神經(jīng)干細胞[4]；(4)經(jīng)誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)體外分化獲得，該途徑來源廣泛，無倫理約束，是體外獲得NSC的較理想的途徑[3-4]。因此尋找一種高效穩(wěn)定的促進iPSC向NSC分化的方法尤為重要。目前誘導iPSC向NSC分化的方法分為2種。(1)擬胚體(embryoid body,EB)法，通過EB誘導iPSC向NSC分化[5]，但EB之間存在異質性，誘導效率不穩(wěn)定，操作繁瑣，不易掌握。(2)單層誘導法，在使用TGF-β和BMP通路的抑制劑的基礎上貼壁誘導iPSC向NSC分化[6-7]。該法可操作性強，容易掌握。但單層誘導法在抑制劑濃度及誘導初始密度等方面存在差異，目前應用較多的單層誘導法主要是根據(jù)2009年Stuart 等[6]及2012年 Shi 等[7]使用的單層誘導干細胞向神經(jīng)干細胞分化的方法。為確定一種穩(wěn)定高效的分化方法，我們比較了這2種方法(前者命名為方法A，后者命名為方法B)誘導神經(jīng)干細胞的效率及獲得的神經(jīng)干細胞的狀態(tài)，并對獲得的神經(jīng)干細胞進行系統(tǒng)鑒定。結果證明方法A獲得NSC的效率高于方法B，且細胞生存狀態(tài)要優(yōu)于方法B。

材 料 和 方 法

1 細胞系和主要試劑

人iPS細胞系是中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康院工作人員提取正常人尿液細胞重編程獲得并命名為UC5的細胞系。

iPSC培養(yǎng)基：mTeSR1；N2B27培養(yǎng)基： 1% N-2 supplement、99% DMEM/F12、2% B-27 supplement、98% Neurobasal混合物。

Matrigel 基質膠和BD Cytofix/CytopermTM固定液/通透液試劑盒購自BD；0.5 mmol/L EDTA消化酶、accutase 消化酶和DMEM/F12基礎培養(yǎng)基購自Gibco；dispase 消化酶、N-2 supplement、B-27 supplement和Neurobasal購自 Life Technologies；SYBR Premix ExTaq 試劑盒購自TaKaRa;anti-Oct4 抗體購自Santa Cruz；anti-Pax6 抗體、anti-nestin polyclonal 抗體和anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)抗體購自Millipore；anti-Sox2 抗體購自R&D； anti-β-tubulin III (TUJ-1)抗體購自Sigma。

2 方法

2.1 iPS細胞傳代培養(yǎng) mTeSR1培養(yǎng)iPS細胞系UC5，待細胞密度達到70%～80%時，0.5 mmol/L 的EDTA消化4～5 min， F12洗1遍， mTeSR1將細胞吹起，1∶3接種于Matrigel預處理的6孔板上。

2.2 誘導iPSC向神經(jīng)干細胞分化 方法A：6孔板中iPCS密度達到70%～80%，2∶1接種至12孔板，24 h后細胞融合密度幾近100%，換誘導分化培養(yǎng)基(N2B27含5 mmol/L SB431542和 5 mmol/L drosomophorin)，記為第0 天，隔天全換液。第8 天，巴氏吸管將細胞刮下，1∶2轉入 Matrigel 預處理的6孔板中，N2B27培養(yǎng)。第9 天觀察，細胞貼壁，換培養(yǎng)基，隔天全換液。第16 天，dispase消化細胞，F(xiàn)12洗1遍，神經(jīng)干細胞維持培養(yǎng)基(N2B27含20 μg/L EGF和20 μg/L bFGF)，將細胞吹起，轉入T25的培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，傳代。方法B：6孔板中iPSC密度達到70%～80%，1∶3接種至6孔板中，24 h后細胞密度40%左右，換誘導分化培養(yǎng)基(N2B27含5 mmoL/L SB431542和 1 mmoL/L drosomophorin)，記為第0天。此后操作同方法A。

2.3 神經(jīng)干細胞傳代 離心收集神經(jīng)球，accutase消化15 min，待神經(jīng)球變松散，F(xiàn)12洗1遍，收集細胞。將其吹成單細胞懸液。移至T25瓶，神經(jīng)干細胞維持培養(yǎng)基(N2B27含20 μg/L EGF和20 μg/L bFGF)培養(yǎng)。1周左右，神經(jīng)球較大,顏色變暗，不透明，即可傳代。

2.4 實時熒光定量PCR (real-time PCR) 收集誘導第16 天 NSC，Trizol法提取細胞總RNA，使用Thermal Cycler Dice Real Time 系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq 試劑盒進行real-time PCR，擴增多能性基因Oct4、Nanog及NSC相關基因Pax6、nestin、Sox1、Sox2。GAPDH作為內參照。相關引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列表

2.5 流式細胞術檢測Pax6陽性率 收集第16 天不同方法誘導的細胞，accutase消化，離心收集細胞，PBS洗1遍，流式固定液常溫避光固定20 min，PBS洗1遍，流式專用通透液4 ℃通透10 min，1∶200加入Pax6及同型對照抗體，常溫孵育1 h。PBS洗掉抗體，重懸，上機檢測。

2.6 免疫熒光分析 將NSC的單細胞或小球種在Matrigel預處理的玻片上，24 h后，4%多聚甲醛常溫固定20 min，PBS洗3遍，孵育 I 抗：Oct4(1∶50)、 Pax6(1∶1 000)、nestin(1∶1 000)、Sox2(1∶100)、TUJ-1(1∶1 000)、MAP2(1∶1 000)和GFAP(1∶500)，I抗稀釋液 (含1% BSA、10% 羊血清和0.3% Triton X-100的PBS) 4 ℃過夜。PBS洗3遍，孵育II抗(1∶500)，常溫避光1.5 h，PBS洗3遍，常溫孵育DAPI(1∶5 000) 5 min，PBS洗3遍，封片。

2.7 神經(jīng)干細胞自發(fā)分化 將神經(jīng)干細胞單細胞接種在明膠預處理的玻片上，第2 天換自發(fā)分化培養(yǎng)基(N2B27含10 μg/L BDNF、10 μg/L GDNF和 1 mg/L cAMP)。培養(yǎng)30 d，免疫熒光檢測神經(jīng)元及星形膠質細胞的特異性標志物TUJ-1、MAP2和GFAP的表達。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。2組間數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗。以P<0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 鏡下觀察不同時間點細胞形態(tài)變化

第0天，細胞克隆狀生長，典型的干細胞克隆,細胞核大，核仁明顯；第12 天左右開始出現(xiàn)花環(huán)樣結構；第16 天花環(huán)結構明顯。第19天，方法A獲得的P0代神經(jīng)干細胞聚集成圓球形，透明；而方法B獲得的P0代神經(jīng)干細胞聚集不規(guī)則，色灰暗，不透明，見圖1。

2 Real-time PCR檢測多能性及神經(jīng)干細胞相關基因的表達

Figure 1.The cell morphology in different days.

Real-time PCR結果顯示,第16天方法A誘導獲得的細胞其神經(jīng)干細胞相關基因Pax6、nestin、Sox1和Sox2的表達量明顯高于方法B獲得的細胞，且差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A、B方法誘導獲得細胞均不表達多能性基因Oct4和Nanog，見圖2。

Figure 2.Comparison of the expression levels of Oct4， Nanog, Pax6, nestin, Sox1 and Sox2 at 16 d.Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs A.

3 流式細胞術分析第16 天誘導細胞Pax6的陽性率

流式細胞術結果顯示，第16天方法A誘導獲得細胞Pax6的陽性率高于方法B，且差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖 3。

Figure 3.The expression level of Pax6 in the cells induced by method A and method B.

以上結果說明方法A誘導獲得的神經(jīng)干細胞的效率較方法B高，因此我們選擇方法A作為誘導iPSC向神經(jīng)干細胞分化的方法。

4 方法A誘導獲得細胞的鑒定

4.1 免疫熒光檢測多能性及神經(jīng)干細胞相關蛋白的表達 免疫熒光結果證明：方法A獲得的NSC不表達Oct4，而高表達神經(jīng)干細胞相關蛋白Pax6、nestin和Sox2，見圖4。

4.2 神經(jīng)干細胞自發(fā)分化能力檢測 自發(fā)分化第30天，鏡下可清楚看到神經(jīng)纖維束，相互交錯、連接形成神經(jīng)網(wǎng)絡。免疫熒光結果顯示，該細胞表達神經(jīng)元的特異性標志物TUJ-1和MAP2及星形膠質細胞的特異性標志物GFAP，見圖5。

Figure 4.Immunostaining of iPSC (UC5) and NSC for the indicated markers.Scale bar=50 μm.

Figure 5.Spontaneous differentiation of NSC in vitro. A： bright-field images of spontaneously differentiated cells from iPSC (UC5)； B: immunostaining of spontaneously differentiated cells for the indicated markers TUJ-1, MAP2 and GFAP.

討 論

目前體外誘導iPSC向NSC分化的思路：抑制iPS向中、內胚層分化，促進其向極化的神經(jīng)外胚層轉化，進而形成玫瑰花環(huán)狀的經(jīng)典神經(jīng)干細胞，高表達nestin、Pax6、Sox1、Sox2等NSC標志物[4]。而TGF-β、BMP信號通路在這一過程中起到關鍵性作用[8-10]。因此單層誘導方法是在N2B27培養(yǎng)基的基礎上添加TGF-β、BMP通路的小分子抑制劑SB431542和dorsomorphin，貼壁誘導。但抑制劑的濃度及誘導初始密度存在差異，這是否會影響iPSC向NSC分化的效率？對此，我們整體比較了A、B這2種方法，包括抑制劑濃度及誘導初始密度。方法A的SB431542和dorsomorphin的濃度均為5 mmol/L，誘導初始密度100%；方法B的SB431542濃度為5 mmol/L， dorsomorphin的濃度為1 mmol/L，誘導初始密度40%左右。結果證明方法A誘導獲得細胞神經(jīng)干細胞相關基因的表達高于方法B獲得的細胞，細胞狀態(tài)優(yōu)于方法B，且方法A獲得的神經(jīng)干細胞連續(xù)傳代性強。用方法A獲得的NSC的鑒定結果證明，NSC高表達nestin、Pax6、Sox2等NSC特異性標志物，且可自發(fā)分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞。因此，我們推薦方法A作為誘導iPSC向NSC分化的方法。

在誘導分化過程中，我們發(fā)現(xiàn)，對于方法A，當誘導密度較小，未達到100%，即換用誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)時，細胞狀態(tài)較差，死亡較多，誘導效率明顯受到影響。推測可能由于抑制劑濃度大，細胞毒性大，當密度較小，細胞間空隙較大時，抑制劑對細胞的毒性超過了細胞的耐受能力，因此導致細胞的狀態(tài)較差，死亡較多。對于方法B，當細胞密度較大時，在誘導至第8天之前，細胞密度達到一定極限，導致細胞漂起，死亡，誘導不能繼續(xù)?？赡苡捎谝种苿ヾorsomorphin的濃度較小，細胞毒性小，細胞狀態(tài)好，增長速度快，密度達到一定極限，繼而生長狀態(tài)下降，最后漂起，死亡。對比2種方法，我們推測抑制劑濃度、細胞毒性及細胞的密度3者之間存在一個平衡點，該平衡點可以維持細胞基本的生存狀態(tài)至第8 天傳代。方法A的抑制劑濃度、細胞毒性與細胞密度達到這個平衡點，故獲得的NSC的效率較方法B高，細胞狀態(tài)好。目前，NSC至少可傳至20代左右，但是神經(jīng)干細胞的增殖能力不強，擴增效率不理想，因此我們將對NSC的增殖能力做進一步的研究。

致謝：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院潘光錦課題組提供了誘導所需的iPS及相關的實驗場所和設備，廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的潘光錦老師、郭易平老師，以及蘇整會、李希芮等同學在細胞培養(yǎng)技術和分子生物實驗技術方面給予了寶貴的指導和幫助，在此一并致以由衷的感謝！

[1] Aboody K, Capela A, Niazi N, et al. Translating stem cell studies to the clinic for CNS repair: current state of the art and the need for a Rosetta stone[J]. Neuron, 2011, 70(4):597-613.

[2] 李 欣，廖新學，馮鑒強，等. 胚胎海馬來源干細胞移植治療缺血性腦梗死的研究[J].中國病理生理雜志，2009, 25(8):1474-1480.

[3] 陶 靖，葛 堅，陳系古，等. 體外誘導小鼠胚胎干細胞分化為神經(jīng)干細胞的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志，2003, 19(3):289-292.

[4] Wang LH, Wang LL, Huang WH, et al. Generation of integration-free neural progenitor cells from cells in human urine[J]. Nat Methods, 2013, 10(1):84-89.

[5] 馮年花，謝 安，王 泱，等.人誘導性多能干細胞向神經(jīng)干細胞分化的方法探討 [J]. 中國病理生理雜志，2010, 26(8):1662-1664.

[6] Stuart MC, Christopher AF, Lorenz S, et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling[J]. Nat Biotechnol, 2009, 27(3):275-280.

[7] Shi YC, Peter K, Frederick JL. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks[J]. Nat Protoc, 2012, 7(10):1836-1846.

[8] Boris G, Philippe C, Hans RS, et al. FGF signaling inhibits neural induction in human embryonic stem cells[J]. EMBO J, 2011, 30(24):4874-4884.

[9] Paul AW, Ali Hemmati-Brivanlou. Vertebrate neural induction: inducers, inhibitors, and a new synthesis[J]. Neuron, 1997, 18(5):699-710.

Comparison of 2 methods for inducing iPSC to differentiate into neural stem cells

YANG Tan1, 2, LIU Hua2, 3, WANG Yun-shan2, 3

(1InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences,SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences，2CentralLaboratory,JinanCentralHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，3ShandongResearchCenterofTransplantationandTissueEngineering,Jinan250013,China.E-mail:sdjnwys@163.com)

AIM: To select an efficient way of promoting induced pluripotent stem cells (iPSC) to differentiate into neural stem cells (NSC) by comparing 2 methods. METHODS: The culture system in method A contained SB431542 (5 mmol/L) and drosomophorin (5 mmol/L) with 100% initial cell density， while that in method B contained SB431542 (5 mmol/L) and drosomophorin (1 mmol/L) with 30%～50% initial cell density. For comparison and identification of the 2 methods, the growth state was observed under microscope, and the expression of Pax6, nestin, Sox1 and Sox2 was quantitatively detected by real-time PCR and flow cytometry . The related protein expression and the ability of spontaneous differentiation were determined by immunofluorescence analysis. RESULTS: The cells derived from method A with 5 mmol/L of SB431542 and drosomophorin and 100% initial cell density achieved the higher expression of Pax6, nestin, Sox1 and Sox2. The growth state was better and the cells differentiated into neurons and astrocytes normally. CONCLUSION: The method A was superior to method B, and we recommend the method A with 5 mmol/L of SB431542 and drosomophorin and 100% initial cell density as the method for differentiating NSC.

Induced pluripotent stem cells; Differentiation; Neural stem cells

1000- 4718(2015)01- 0188- 05

2014- 09- 23

2014- 11- 03

973 計劃資助項目(No. 2012CB966503; No. 2012CB966504);國家青年科學基金資助項目(No. 81200950)

△通訊作者 Tel: 0531-85695368; E-mail: sdjnwys@163.com

R33-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.035