林憲慧， 余俊華， 林海鴻， 屠洋洋， 羅順斌， 徐 濤， 陳 統(tǒng)， 林型城， 葉孫志， 鄭志強△， 蔡劍平△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027； 2衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部老年醫(yī)學重點實驗室，北京 100730)

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人胃癌及癌旁組織RNA氧化損傷水平的比較及臨床意義

林憲慧1， 余俊華1， 林海鴻1， 屠洋洋1， 羅順斌2， 徐 濤2， 陳 統(tǒng)1， 林型城1， 葉孫志1， 鄭志強1△， 蔡劍平2△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027；2衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部老年醫(yī)學重點實驗室，北京 100730)

目的： 通過檢測人胃癌組織及其癌旁組織中的RNA氧化損傷程度，探討RNA氧化與胃癌發(fā)生的相關性。方法: 分別利用免疫組化方法和液相-串聯質譜(LC-MS/MS)方法對61例胃癌組織及其癌旁組織中8-氧鳥苷(8-oxoGsn)進行定性和定量分析，并統(tǒng)計分析結果。結果: 免疫組化結果檢測顯示8-oxoGsn在癌旁組織中含量低，而在胃癌組織中含量明顯增高，且棕色染色區(qū)域主要集中在腫瘤細胞胞漿位置。質譜檢測結果顯示胃癌組織中8-oxoGsn含量較對應癌旁組織高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論: 8-oxoGsn在胃癌組織中含量增加。RNA氧化損傷可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

胃腫瘤； 免疫組織化學； 8-氧鳥苷； 液相-串聯質譜

十幾年前，RNA的氧化損傷很少受到人們的關注。傳統(tǒng)的觀念認為RNA損傷修復遠不如DNA損傷修復重要。然而，隨著RNA甲基化損傷修復機制及RNA修復酶的發(fā)現，這一觀點受到了巨大的挑戰(zhàn)。據研究，與其它細胞組分相比，RNA更易受到氧化損傷。Nunomura等[1]采用原位免疫組化法檢測了阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)患者腦組織中的氧化核苷水平，結果顯示，大多數氧化核苷是由細胞質RNA氧化而成，而不是細胞核DNA和線粒體DNA。在其它多種神經退行性疾病、表達SOD1G93A突變體的ALS轉基因小鼠模型(SOD1G93A小鼠)以及氧化應激細胞培養(yǎng)模型中也觀察到這種現象[2-4]。這些研究表明，RNA比DNA更易受到氧化損傷。此外，SOD1G93A小鼠的RNA氧化研究顯示[2]，癥狀前期SOD1G93A小鼠的脊髓中，蛋白質羰基化和脂質過氧化水平不升高(或僅輕微地升高)，而RNA氧化水平顯著升高。這表明RNA可能比蛋白質、脂類更易受到氧化損傷。RNA氧化修飾會干擾翻譯過程并使蛋白質合成減少或合成錯誤蛋白質，這可能會導致細胞退化甚至死亡。也有學者認為RNA氧化可能不是細胞死亡的結果，而是人類多種疾病(如阿爾茲海默病、帕金森病以及腫瘤)發(fā)病的一個早期事件[5]。雖然目前很少有文獻報道RNA氧化與腫瘤的關系。但是，根據大量的研究，我們發(fā)現RNA氧化損傷可能會加速多種人類疾病的惡化。因此為了更加深入的探討這個問題，筆者研究了RNA氧化損傷與胃癌發(fā)生之間的相關性。

細胞正常代謝產生的多種自由基以及外源性自由基中，羥自由基(OH·)具有高反應性，能引起生物大分子(包括RNA)的直接氧化損傷。由于羥自由基的高反應性和不易擴散性，在RNA附近生成的羥自由基可以很容易地對RNA進行氧化修飾。因此，羥自由基介導的氧化修飾作用可能是RNA損傷的重要方式之一。目前發(fā)現，羥自由基能損傷20多種不同類型的堿基[6]。其中8-氧鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoGua)是最常見的RNA氧化堿基，是公認的最重要的RNA氧化標志物。因此本研究通過免疫組化法對胃癌及癌旁組織中8-氧鳥苷(8-oxoguanosine，8-oxoGsn)進行檢測，并利用LC-MS/MS對其進行定量檢測，從而來探討RNA氧化損傷與胃癌發(fā)生的相關性。

材 料 和 方 法

1 材料、主要儀器和試劑

人胃癌組織61例及其對應的癌旁組織標本來自于溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院胃腸外科2009～2013年間臨床病理確診的胃癌手術患者。其中男性45例，女性16例，患者臨床資料如表1所示，所有患者術前均未行放化療。取手術切除胃癌組織及癌旁15 cm以上組織，立即放于液氮中保存，該操作均術前告知患者及其家屬并簽署知情同意書。

Agilent 1290 Infinity液相系統(tǒng)、Agilent 6490 三重四級桿質譜系統(tǒng)、Qualitative Analysis B.06.00及QQQ Quantitative Analysis數據分析軟件(Agilent)；KUBOTA 3740低溫離心機(KUBOTA)；分光光度計(Eppendorf)；520A型pH計(ORION)；JY600C型電泳儀(中國君意東方電泳設備有限公司)；超凈工作臺(中國北京長城空氣凈化工程公司)；烤片機(中國天津天力機電有限公司)；冰凍切片機(Thermo)。

表1 組織來源患者的臨床病理資料

[13C,15N2]8-oxoGsn (Toronto Research Chemicals)；[15N5]Gsn(Cambridge Isotope Laboratories)；甲磺酸去鐵銨(Sigma)；TRIzol(Invitrogen)；蛋白酶K(AMERESCO)；核酸酶P1(WAKO)；堿性磷酸酶(NEB)；鼠抗8-oxoGua單克隆抗體(Abcam)；RNase-free DNase I(TaKaRa)；色譜級甲醇、乙腈、醋酸銨(Fisher Scientific)；免疫組化試劑盒PV6000、DAB顯色劑、抗體稀釋液、伊紅、蘇木素、丙酮(北京中衫金橋生物科技有限公司)；異丙醇、氯仿、乙醇、冰醋酸等試劑均為分析純(北京化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 免疫組化 將已烘烤2 h并冷卻的冰凍切片水化5 min，用1% Triton X-100處理10 min使其破膜；PBS洗滌5 min×3次；37 ℃ DNase 1×106U/L處理1 h，PBS洗滌 5 min×3次；用正常山羊血清室溫孵育封閉30 min；吸棄封閉液后滴加適當比例稀釋的小鼠來源抗8-oxoGua單克隆抗體(1∶100)之后4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌 5 min×3次；3%過氧化氫避光孵育20 min，消除內源性過氧化物酶，PBS洗滌 5 min×3次，以去除殘留的過氧化氫；II抗孵育30 min，PBS洗滌 5 min×3次；鏡下DAB控制顯色，約1 min，用水終止顯色；空白對照組用抗體稀釋液代替抗體孵育過夜；蘇木素染色1 min；鹽酸乙醇洗滌3次；水洗10 min；70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇依次脫水2 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ 分別透明5 min；明膠封片后鏡下觀察。

2.2 胃癌組織及癌旁組織RNA抗氧化提取并消化 取適量(約100 mg)組織于研缽，加入液氮，將組織研磨成細粉(防止組織融化)；取粉末裝于1.5 mL EP管；加入1 mL TRIzol(含1 mmol/L甲磺酸去鐵銨，進一步降低RNA在體外的人為氧化)，吹打混勻，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，蓋緊蓋子，用手搖勻15 s，室溫靜置3 min；4 ℃、12 000×g離心10 min；取上層約500 μL至一新的EP管；加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min；4 ℃、12 000×g離心10 min；此時可見白色沉淀，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌(0.1% DEPC水配制)，4 ℃、10 000×g離心5 min；重復洗滌 1 次；吸棄乙醇；待沉淀干燥后，加入適量0.1% DEPC水(含1 mmol/L 甲磺酸去鐵銨)；測其吸光度(A)值；根據所測濃度取20 μg RNA于新的EP管中，用0.1% DEPC水定容至79.5 μL；100 ℃金屬浴變性3 min，插入冰中急速冷卻；加入10 μL核酸酶P1，混勻；37 ℃水浴孵育2 h，期間在30 min和60 min時各混勻1次；加入10.5 μL堿性磷酸酶，混勻；37 ℃水浴孵育1 h，期間在30 min時混勻 1 次；孵育結束后，4 ℃ 10 000×g離心5 min；取90 μL上清于內插管中，加入5 μL [13C,15N2]8-oxoGsn(50 μg/L)和5 μL [15N5]Gsn(25 mg/L)，吹打混勻，直接進行質譜檢測或保存于-80 ℃。

2.3 LC-MS/MS檢測 液相色譜條件：色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HT(3.0*100mm)1.8-Micron 600 Bar；流動相：A液為5 mmol/L醋酸銨(pH=3.75)，B液為甲醇。梯度洗脫如下：0～5 min：A相從90%～50%，B相從10%～50%；5～5.01 min：A相從50%～90%，B相從50%～10%；5.01～7.5 min：A∶B為90∶10；流速：0．3 mL/min；柱溫：35 ℃，進樣量2 μL，整個分析時間為7.5 min。質譜條件：電噴霧(ESI)離子源正離子模式，多反應檢測掃描(MRM)；噴霧器氣溫：200 ℃；噴霧器氣流：14 L/min；噴霧器：20 psi；鞘氣流溫度：400 ℃；鞘氣流流速：11 L/min；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：1 500 V；駐留時間：100 ms；8-oxoGsn、Gsn及其同位素內標檢測離子對參數見表2。

表2 正離子模式下8-oxoGsn、Gsn及其對應的同位素內標的離子源參數

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計，數值變量用均數±標準差(mean±SD)表示。用t檢驗判定2組均數差異顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 8-oxoGua在胃癌組織及癌旁組織中的分布

免疫組化提示胃癌及癌旁組織細胞胞漿中均可以檢測到8-oxoGua，而其在胃癌組織中的含量明顯增加，見圖1。

Figure 1.The results of 8-oxoGua immunohistochemical observation after pre-treatment with DNase in the gastric can-cer tissues and para-carcinoma tissues.

2 LC-MS/MS檢測體系的建立

如圖2所示，樣品中Gsn、8-oxoGsn與其各自的內標[15N5]Gsn、[13C,15N2]8-oxoGsn出峰時間一致，峰形完整、結果可靠，在本實驗條件下，8-oxoGsn最低檢測量可達0.2 pg。

3 胃癌組織及對應癌旁組織之間RNA氧化程度的差異

本研究用LC-MS/MS檢測方法平行檢測61組胃癌及癌旁組織RNA中8-oxoGsn及Gsn的含量，RNA氧化損傷程度以每106個Gsn中含8-oxoGsn個數的平均值表示。如圖3所示，胃癌組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn的含量為5.888±2.932，癌旁組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn的含量為4.469±2.876，胃癌組織比癌旁組織高24.1%(P<0.05)。對61例組織進行分型研究發(fā)現，胃腺癌或印戒細胞癌中均存在類似現象，見圖4，表明RNA氧化損傷可能與胃癌發(fā)生之間存在著一定的聯系。

討 論

許多RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7-10]，而腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一是氧化應激水平的增高。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等產生過多，氧化程度超出機體氧化物的清除能力，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致組織損傷的過程。對氧化應激量化評價的重要指標主要是測定由活性氧修飾的化合物以及測定活性氧清除酶和抗氧化物質的量。由于我們考慮RNA氧化損傷是否與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關系，因此選擇了近年被廣泛認可的活性氧修飾化合物8-oxoGsn作為氧化標志物。

Figure 2.The LC-MS/MS detection figure of 8-oxoGsn, Gsn and the corresponding isotopic mark.

Figure 3.The levels of 8-oxoGsn in the human gastric cancer and para-carcinoma. Mean±SD. n= 61. *P<0.05 vs para-carcinoma tissue.

Figure 4.The levels of 8-oxoGsn in adenocarcinoma, signet-ring cell carcinoma and their corresponding para-carcinoma. Mean±SD. *P<0.05 vs para-carcinoma tissue.

目前對8-oxoGsn的檢測技術大致可以分為兩類，即免疫分析法和色譜法[5]。免疫分析法中又分為免疫組化法、免疫熒光法和ELISA法等，免疫組化法和免疫熒光法可用于細胞中8-oxoGsn的定性分析和半定量分析；ELISA方法則可以用于血漿、尿液及其它體液中8-oxoGsn的定量分析。由于受到所用抗體特異性以及其它與底物結構類似物的影響，免疫分析法很難得到準確可靠的定量數據。色譜法因其敏感度高、線性好、分析準確及非特異干擾小的優(yōu)點而被廣泛應用，其中包括HPLC-ECD、GC-MS、LC-MS/MS等。LC-MS/MS因其串聯質譜的多反應檢測模式可以最大程度提高檢測方法的特異性，該方法通過液相色譜階段分離樣品中的雜質，再用串聯質譜根據化合物母離子和子離子對的不同來區(qū)分生物樣品中的8-oxoGsn和Gsn，具有通量高、敏感度高和特異性強的特點。因此，為了更加準確的檢測組織中RNA的氧化產物8-oxoGsn的含量，我們采用同位素稀釋LC-MS/MS，該檢測體系敏感度高，分析準確，非特異干擾小，最低定量可以達到0.2 pg，能夠準確地檢測胃癌及癌旁組織中的8-oxoGsn的含量。

本研究對RNA氧化損傷重要標志物8-oxoGsn的檢測結果表明，胃癌組織中的8-oxoGsn/106Gsn平均值為5.888±2.932，癌旁組織RNA中8-oxoGsn/106Gsn平均值為4.469±2.876，胃癌組織比癌旁組織高24.1%(P<0.05)，表明RNA氧化損傷可能與腫瘤發(fā)生有關。不同類型胃癌如印戒細胞癌和腺癌中均存在癌組織中RNA氧化程度高于癌旁組織的情況。此外，印戒細胞癌RNA氧化程度明顯高于腺癌，也可能與印戒細胞癌例數不夠多有關。

也有學者研究了日常飲食是否會對8-oxoGsn和8-oxodGsn的檢測結果有影響，他們得出日常飲食并不會影響這些生物分子在尿液中排泄的結論[11]。另外還有研究表明日常飲食對血液中8-oxoGsn和8-oxodGsn的含量也沒有影響[12]。還有文獻報道8-oxoGsn和8-oxodGsn的水平增高也會出現在其他器官中[13]。而且我們發(fā)現胃癌組的8-oxoGsn含量明顯高于癌旁組，因此我們可以考慮將8-oxoGsn作為胃癌的一個腫瘤標志物。

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Level and clinical significance of RNA oxidative damage in human gastric cancer and para-carcinoma tissues

LIN Xian-hui1, YU Jun-hua1, LIN Hai-hong1, TU Yang-yang1, LUO Shun-bin2, XU Tao2, CHEN Tong1, LIN Xing-cheng1, YE Sun-zhi1, ZHENG Zhi-qiang1, CAI Jian-ping2

(1DepartmentofGeneral,SecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2TheKeyLaboratoryofGeriatrics,BeijingHospital，BeijingInstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,Beijing100730,China.E-mail:zhe-zhi2000@yahoo.com.cn;caijp61@vip.sina.com)

AIM: To investigate the RNA oxidative damage in human gastric cancer tissue and para-carcinoma tissue for exploring the role of RNA oxidation in the occurrence of gastric cancer. METHODS: Immunohistochemical observation and LC-MS/MS analysis were performed in 61 cases of gastric carcinoma. The position and concentration of 8-oxoguanosine (8-oxoGsn) were detected, respectively. RESULTS: The results of immunohistochemical observation showed that 8-oxoGsn was obviously up-regulated in the gastric cancer. The positive staining mainly accumulated in the cytoplasm of the tumor cells. The results of mass spectrometry showed that the level of 8-oxoGsn in the gastric cancer tissues was higher than that in the para-carcinoma tissues (P<0.05). CONCLUSION: 8-oxoGsn is up-regulated in gastric cancer. RNA oxidative damage may play important roles in the occurrence of gastric cancer.

Stomach neoplasms; Immunohistochemistry; 8-oxoguanosine; LC-MS/MS

1000- 4718(2015)01- 0172- 05

2014- 09- 16

2014- 11- 18

△通訊作者 鄭志強 Tel： 0577-88653538； E-mail： zhe-zhi2000@yahoo.com.cn； 蔡劍平 Tel： 010-58115039； E-mail： caijp61@vip.sina.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.032