黃冬妹， 何志義， 麻芝英， 肖 影

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

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香煙煙霧對C2C12小鼠成肌細(xì)胞HDAC2及炎癥介質(zhì)的影響*

黃冬妹， 何志義△， 麻芝英， 肖 影

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

目的： 探討香煙煙霧提取物(CSE)對C2C12小鼠成肌細(xì)胞組蛋白去乙?；?2(histone deacetylase 2, HDAC2)和炎癥介質(zhì)的影響。方法: CSE刺激C2C12細(xì)胞，用質(zhì)粒脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實時熒光定量PCR和Western blotting法檢測HDAC2的表達(dá)情況，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果: CSE組細(xì)胞HDAC2的mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)，細(xì)胞上清IL-8和TNF-α的水平明顯高于對照組(P<0.05)；應(yīng)用HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再用CSE刺激細(xì)胞，細(xì)胞HDAC2的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于CSE組及對照組(P<0.05)，細(xì)胞釋放IL-8和TNF-α的量均明顯高于CSE組及對照組(P<0.05)。結(jié)論: 氧化應(yīng)激條件下C2C12小鼠成肌細(xì)胞通過下調(diào)HDAC2表達(dá)使IL-8和TNF-α表達(dá)增多。

氧化應(yīng)激； 組蛋白去乙?；?； 肌萎縮；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)與氣道和肺組織對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。骨骼肌萎縮是COPD常見的并存病，研究顯示COPD病人骨骼肌萎縮可能與肺部炎癥引起的全身性炎癥反應(yīng)有關(guān)[1-4]。因此我們推測氧化應(yīng)激一方面可以導(dǎo)致肺部炎癥，同時可以引發(fā)骨骼肌的炎癥，肺部炎癥和骨骼肌的炎癥具有一致性。目前有關(guān)氧化應(yīng)激對肺部炎癥的研究較多，并認(rèn)為組蛋白去乙酰化酶 2(histone deacetylase 2，HDAC2)與核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在氧化應(yīng)激所致肺部慢性炎癥過程中起重要作用[5]。HDAC2和NF-κB是否也參與了骨骼肌慢性炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致骨骼肌萎縮還有待進(jìn)一步研究。我們前期研究顯示香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)能夠使C2C12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并能明顯上調(diào)炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，進(jìn)而促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，炎癥負(fù)荷的增加抑制了骨骼肌的生長和分化[6]。因此，本研究進(jìn)一步探討HDAC2是否也參與了氧化應(yīng)激下骨骼肌炎癥反應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

小鼠C2C12成肌細(xì)胞株(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心保存)。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體和TRIzol試劑(Invitrogen)；MTT(Sigma)；IL-8和TNF-α ELISA 試劑盒(武漢華美公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；RIPA 蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光底物(Pierce)；HRP標(biāo)記的小鼠抗GAPDH單克隆抗體(上?？党晒?；小鼠抗HDAC2 抗體(Cell Signaling)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司)；所用引物由寶生物工程(大連)有限公司根據(jù)設(shè)計合成； 香煙為萬寶路牌，焦油量11 mg，煙堿量0.8 mg。

3 主要方法

3.1 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)與分化 小鼠成肌細(xì)胞株C2C12在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖DMEM。每2～3 d傳代1次。傳代后C2C12細(xì)胞在含有10%馬血清的培養(yǎng)基下可分化成具有收縮功能的肌小管，分化為成熟肌細(xì)胞一般需6～7 d，分化好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

3.2 香煙煙霧提取物制作 采用簡易冷凝裝置，依靠注射器驅(qū)動連續(xù)抽吸，將煙霧緩慢通入含有20 mL PBS的密閉玻璃容器中，并不斷振蕩使香煙煙霧充分溶解。抽吸完20支煙后收集液體，用紫外分光光度計在320 nm波長測得香煙提取物的濃度。MTT法確定CSE對細(xì)胞的合適作用濃度。

3.3 siRNA合成 根據(jù)HDAC2基因的信息，利用siRNA Designer System按照siRNA干擾片段的設(shè)計原則設(shè)計siRNA序列，送Life Technologies采用化學(xué)方法合成，前期實驗篩選出有效片段，正義鏈為5′-CCACAGCGAUGAGUAUAUCAAGUUU-3′，反義鏈為5′-AAACUUGAUAUACUCAUCGCUGUGG-3′。

3.4 細(xì)胞干預(yù)與分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于24孔板，密度約為1×104cells/well，每組6個復(fù)孔。實驗分為4個組，分別為：(1)空白對照組：即分化成熟的小鼠成肌細(xì)胞組；(2)CSE組：CSE干預(yù)細(xì)胞24 h；(3)HDAC2 siRNA組：用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(4)HDAC2 siRNA+CSE組：先用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后用CSE刺激細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞提取RNA及蛋白進(jìn)行分析，同時收集上清液測定IL-8和TNF-α水平。

3.5 Real-time PCR檢測HDAC2 mRNA在細(xì)胞中的表達(dá) 將上述細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，每孔加入TRIzol提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Light Cycler實時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HDAC2的上游引物為5’-AGCCCATGGCGTACAGTCAA-3’，下游引物為5’-GGGATGACCCTGGCCATAATAA-3’，擴(kuò)增片段長度95 bp；GAPDH上游引物為5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物為5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，擴(kuò)增片段長度150 bp。采用20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各組HDAC2 mRNA相對表達(dá)量。

3.6 Western blotting 法檢測HDAC2蛋白的表達(dá) 用移液管吸去各組培養(yǎng)基，各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，用胰酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基終止消化并將細(xì)胞吹打下來。將消化下來的細(xì)胞懸液移至預(yù)冷的10 mL離心管，1 000 r/min，4 ℃離心10 min。棄上清，按RIPA裂解液說明書提取總蛋白，BCA試劑盒對提取的蛋白進(jìn)行定量，取等量蛋白50 μg進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，分別以HRP標(biāo)記的小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)，小鼠抗HDAC2抗體(1∶1 000)冰上孵育過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)與膜室溫孵育1 h，GAPDH不孵育Ⅱ抗。暗室膠片曝光顯影、定影。Bio-Rad公司的全自動掃描儀掃描膠片，Quantity One 軟件分析結(jié)果。

3.7 各組細(xì)胞上清液IL-8和TNF-α的測定 收集各組細(xì)胞上清液，運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的方法測定各組細(xì)胞上清液IL-8和TNF-α的水平，具體操作步驟按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法確定不同濃度CSE對細(xì)胞活性的影響

CSE作用細(xì)胞24 h，0.1%和0.2%CSE對C2C12細(xì)胞生長無明顯影響(P>0.05)，濃度為0.4%時細(xì)胞生長活性明顯受抑制(P<0.05)。CSE作用細(xì)胞48 h，0.1%濃度的CSE對C2C12細(xì)胞生長無明顯影響(P>0.05)，濃度為0.2%和0.4%時細(xì)胞生長活性明顯受抑制(P<0.05)。CSE作用細(xì)胞72 h，0.1%、0.2%和0.4%濃度的CSE均明顯抑制細(xì)胞生長(P<0.05)，見表1。故本實驗以CSE合適終濃度0.2%作用細(xì)胞24 h進(jìn)行干預(yù)。

表1 不同濃度CSE干預(yù)下C2C12細(xì)胞各時點的A值

*P<0.05vscontrol.

2 各組細(xì)胞HDAC2 mRNA 表達(dá)水平

CSE組、HDAC2 siRNA組和HDAC2 siRNA+CSE組HDAC2 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0.05)，HDAC2 siRNA+CSE組HDAC2 mRNA表達(dá)水平明顯低于CSE組(P<0.05)，見圖1。

3 Western blotting法檢測各組細(xì)胞的HDAC2 蛋白表達(dá)

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，CSE組、HDAC2 siRNA組以及HDAC2 siRNA+CSE的組HDAC2蛋白表達(dá)均低于對照組，HDAC2 siRNA+CSE組低于CSE組；用各組條帶的HDAC2灰度值比各組的GAPDH灰度值得到各組HDAC2蛋白相對表達(dá)量，CSE組、HDAC2 siRNA組以及HDAC2 siRNA+CSE組的HDAC2蛋白相對表達(dá)量均低于對照組，HDAC2 siRNA+CSE組低于CSE組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The mRNA expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

Figure 2.The relative protein expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液炎癥介質(zhì)表達(dá)水平

4.1 各組細(xì)胞釋放IL-8水平 CSE組和HDAC2 siRNA組細(xì)胞釋放IL-8的水平與對照組相比明顯增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細(xì)胞，細(xì)胞釋放IL-8的水平與CSE組相比明顯升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The IL-8 level in the cell supernatant.Mean±SD. n= 3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4.2 各組細(xì)胞釋放TNF-α水平 CSE組和HDAC2 siRNA組細(xì)胞釋放TNF-α的水平與對照組相比明顯增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細(xì)胞，小鼠成肌細(xì)胞釋放TNF-α的水平與CSE組相比明顯升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The TNF-α level in the cell supernatant.Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

討 論

香煙以及其它有害顆粒導(dǎo)致的肺部異常炎癥反應(yīng)不僅局限在肺部而且累及到全身多處器官，引起骨骼肌病變、心血管病變等，同時加重COPD疾病的進(jìn)展[7-8]。骨骼肌是COPD系統(tǒng)性損傷最主要的受累器官，表現(xiàn)為肌肉萎縮和功能障礙[9]。研究顯示COPD病人骨骼肌萎縮與全身性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10-11]。目前認(rèn)為COPD可能是一種全身炎癥反應(yīng)綜合癥，香煙所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激使肺部產(chǎn)生異常過多的炎癥介質(zhì)以及炎癥因子(IL-8、 TNF-α、MMP-9等)溢出到循環(huán)中產(chǎn)生的系統(tǒng)性炎癥可能是導(dǎo)致系統(tǒng)性病變及骨骼肌萎縮的直接原因[12-13]。

本實驗結(jié)果顯示，用CSE刺激小鼠成肌細(xì)胞C2C12，細(xì)胞HDAC2的表達(dá)減少，釋放IL-8和TNF-α的水平升高；而用HDAC2 siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細(xì)胞，HDAC2的表達(dá)減少更加明顯，釋放IL-8和TNF-α的水平顯著升高。這表明CSE刺激小鼠成肌細(xì)胞C2C12可以下調(diào)HDAC2的表達(dá)，而沉默HDAC2基因后，CSE下調(diào)HDAC2的作用更為明顯，炎癥介質(zhì)的釋放顯著增多。這與COPD肺部炎癥機(jī)制具有相似性，COPD病人骨骼肌炎癥可能是肺部炎癥溢出的結(jié)果。有研究顯示COPD病人肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞HDAC2的活性和表達(dá)都下降，IL-8啟動子處的組蛋白乙?；皆龈遊5]。另外，大量研究表明在COPD肺部氧化應(yīng)激引起的HDAC2下降使得組蛋白乙酰化活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起DNA雙鏈打開，使得炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等易與DNA結(jié)合，啟動炎癥基因轉(zhuǎn)錄過程，從而炎癥介質(zhì)釋放增加[5]。本研究結(jié)果顯示HDAC2在CSE引起的小鼠成肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起到重要作用， HDAC2是否是通過NF-κB調(diào)控IL-8和TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放還需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of cigarette smoking condensate on HDAC2 and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells

HUANG Dong-mei, HE Zhi-yi, MA Zhi-ying, XIAO Ying

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:zhiyi-river@163.com)

AIM: To investigate the effect of cigarette smoking condensate on histone deacetylase 2 (HDAC2) and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells. METHODS: C2C12 cells were treated with cigarette smoke extract (CSE).HDAC2 siRNA was transfected into the cells using LipofectamineTM2000. The levels of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the culture supernatants were measured by ELISA, and the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blotting. RESULTS: The expression of HDAC2 at mRNA and protein levels in CSE group was lower than that in control group (P<0.05). The supernatant levels of IL-8 and TNF-α in CSE group were significantly higher than those in control group (P<0.05). When the cells were transfected withHDAC2 siRNA followed by CSE stimulation, the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was decreased, and the supernatant levels of IL-8 and TNF-α were significantly increased as compared with CSE group and control group (P<0.05).CONCLUSION: Under the oxidative stress condition, C2C12 cells generate high levels of IL-8 and TNF-α by down-regulating the expression of HDAC2.

Oxidative stress; Histone deacetylase 2; Muscular atrophy; Chronic obstructive pulmonary disease

1000- 4718(2015)01- 0008- 04

2014- 09- 03

2014- 10- 14

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81260012； No.81160009)

△通訊作者 Tel： 0771-5356702； E-mail: zhiyi-river@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.002